GENETICA VETERINARIA

Autor: FERNÁNDEZ DEL NACIMIENTO CRISTINA.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La miostatina es un miembro de la familia de los Factores de Crecimiento y Transformación (TGFbeta) responsable de la inhibición del desarrollo de la masa muscular. El ganado bovino con mutaciones inactivantes en la miostatina presenta un considerable aumento de su masa muscular conocido como hipertrofía muscular o cularidad. Este incremento muscular está acompañado de una disminución igualmente considerable de la cantidad de grasa que se traduce en un claro incremento del valor económico de sus canales. El aumento del conocimiento de la estructura y función de la miostatina ha puesto en marcha el desarrollo de metodologías destinadas a manipular su funcionamiento o evitar los efectos indeseados asociados al fenotipo culón. En la primera línea de investigación seguida en esta tesis se ha planteado crear un sistema que permita estudiar la reversbilidad del fenotipo hipertrófico a fenotipo normal. Para ello se ha realiz ado la construcción de un sistema "Mstn OFF to ON". En este sistema el tercer exón de la miostatina está en posición invertida pero es susceptible de volver a la posición permanentemente activa mediante el sistema Cre/lox, utilizando una variante de lox mutados. Este sistema se ha probado in vitro y en un sistema bacteriano, en los que se ha demostrado su capacidad de pasar de una configuración inactiva a una activa, manteniéndose además en este último estado. Por el contrario, cuando se realizó una integración estable por recombinación homóloga en células ES murinas, no se consiguió revertir a la configuración activa, probablmente debido a la utilización de un promotor demasiado débil para que la expresión de la Cre-recombinasa resultara adecuada ante los lox mutados utilizados. Aunque esta línea de investigación se ha interrumpido en este punto, estos resultados apuntan hacia la posibilidad de utilizar vectores de Cre más aptos para lograr la recombinación esperada entre lox mutados. La segunda línea de estudio de esta tesis ha consistido en la creación y evaluación de distintos alelos de la miostatina potencialmente dominantes negativos. El fenotipo culón típico sólo se presenta en estado de homocigosis; por ello es indudable el interés zootécnico de obtener terneros heterocigotos culones en cruces industriales, así como la posible aplicación postnatal de estos alelos para eliminar los efectos perinatales asociados al fenotipo culón. Así, se han planteado tres alelos dominantes negativos potencialmente capaces de anular la función de la miostatina salvaje en su presencia. Estas tres variantes se han diseñado de modo que se impida su unión al receptor específico de membrana por impedimiento estérico. Dado que esta estrategia de dominancia negativa depende básicamente de la capacidad de dimerización entre monómeros salvajes y monómeros mutantes se han realizado dos ensayos de iteracción para confirmar que la unión entre monómeros no se ha visto alterada. Estos ensayos confirmaron que las tres variantes dominantes negativas diseñadas son perfectamente capaces de formar dímeros con los monómeros salvajes, y además, que esta unión no es significativamente diferente de la unión existente entre dos monómeros salvajes. Por lo tanto, los alelos diseñados cumplen el primer requisito imprescindible en una estrategia de dominancia negativa.

Autor: CALONGE ERREJON M. ESTHER.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: El primer objetivo de esta tesis es la comparación de los patrones de expresión de animales de la raza bovina asturiana de los valles afectados pro hipertrofia muscular provocada por una deleción de 11pb en el gen de la miostatina, frente a animales normales . El segundo objetivo es la identificación de los genes que se expresan. Diferencialmente y por último la relación de estos genes y las rutas metabólicas en las que participan con la aparición de hipertrofia muscular. Para ello se utiliza la técnica de estudio de expresión diferencial "Diferencial Display"y se comprueban los resultados mediante la técnica de "PCR CUANTITATIVA". Las muestras que se utilizan son músculos de animales de la raza asturiana de los valles de los tres genotipos posibles para la deleción 11.Se detectan genes que se expresan de manera distinta en los animales con hipertrofia con respecto a los normales.Algunos genes surgen un aumento de expresión y otros presentan una disminución. Los genes encontrados están relacionados con transducción de señales, metabolismo de lípidos , ciclo celular, diferenciación de músculo y metabolismo energetico.Se consigue tener una visión general de las rutas activadas en el músculo esquelético diferencial de otros genes con funciones poco conocidas o desconocidos totalmente, que abren nuevas vías en el estudio de la hipertrofia muscular bovina.

Autor: MEDRANO DIAZ ANTONIO ARVELO.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: El primer objetivo de este estudio fue determinar los mecanismos de utilización energética de diferentes monosacáridos (glucosa, fructosa, manosa y sorbitol), por parte de los espermatozoides de cerdo. Para ello, los espermatozoides fueron incubados sin ningún sustrato energético y con diferentes hexosas. Las concentraciones utilizadas de las hexosas fueron de 10 mM, siempre que se quería determinar el efecto del tiempo de incubación, y de lmM, 5mM, 10mM, 20 mM, 50mM cuando lo que se pretendía determinar era el efecto de la concentración del sustrato metabolizable. Las incubaciones se realizaron durante 5 min., 15 min., 30 min., y 60 min., para el caso del efecto tiempo, y durante 60 minutos para analizar el efecto concentración. Las incubaciones fueron realizadas en un medio de Krebs-Ringer-Henseleit carente de substratos energéticos. Tras estas incubaciones" se determinaron tanto la viabilidad como el estado de los acrosomas como marcadores funcionales del estado de los espermatozoides. También se determinaron los niveles intracelulares de algunos metabolitos energéticos, como la glucosa 6-fosfato, el glucógeno y el trifosfato de adenosina (ATP). Además, también se midió el ritmo de formación de L-Lactato extracelular proveniente de la glucólisis y el de CO2 como producto final del ciclo de Krebs. La conclusión más relevante extraída de este estudio fue que la glucosa es el monosacárido utilizado preferentemente por los espermatozoides de cerdo. Esta glucosa es metabolizada principalmente por la vía glucolítica (en un 99%). Finalmente, el control de la vía de consumo de la glucosa se realiza básicamente en dos puntos, el primero la modulación de la actividad hexoquinasa, y el segundo la modulación de la actividad piruvato quinasa. Como complementación del estudio anterior, también se estudió el comportamiento cinético de las principales actividades enzimáticas que controlan la ruta glucolítica, como son la hexoquinasa, que regula la fosforilación inicial de los monosacáridos, y la piruvato quinasa, que regula la introducción del producto final de la glucólisis en el ciclo de Krebs. Estos estudios mostraron que la hexoquinasa tiene una afinidad muy superior hacia la glucosa cuando la comparamos con los otros monosacáridos estudiados, mientras que la piruvato quinasa muestra una gran dependencia en su actividad del equilibrio intracelular entre los niveles de bifosfato de adenosina (ADP) y de ATP, lo que permite un control muy sensible de la obtención de energía a través del flujo glucolítico. Finalmente, también se evaluó el patrón de fosforilación en residuos de tirosina en los espermatozoides de cerdo. Los extractos celulares mostraron un patrón uniforme, con una banda de fosforilación mayoritaria a 45 Kda de peso. Este patrón no sufrió cambios significativos tras la incubación con cualquiera de los azúcares. Este resultado indica la falta de una acción moduladora específica de los azúcares sobre la funcionalidad espermática porcina. Otro de los objetivos consistió en evaluar la utilización de sustratos no glucolisables, y por lo tanto, no utilizables a través de la glucólisis, para la obtención de energía como el citrato y ellactato por parte de los espermatozoides de cerdo. El diseño experimental sobre concentraciones y tiempos de incubación fue igual al ya descrito para los monosacáridos. Las incubaciones también se realizaron en un medio de Krebs-Ringer-Henseleit carente de azúcares, y los parámetros evaluados fueron los mismos que en la primera fase de este trabajo. Además, en este caso se determinó el comportamiento cinético de la actividad lactato deshidrogenasa (LDH) como punto clave de control de la entrada de substratos hacia el ciclo de Krebs. Este estudió estableció la presencia de un tipo de LDH específico de esperma en el espermatozoide de cerdo, lo que fue evidenciado a través del análisis del Western blot y confirmado por los resultados de inmunocitoquímica, los cuales mostraron una reacción positiva en la pieza principal de la cola, con una dé 8 bil seña d8d l en la pieza intermedia. La conclusión principal que se pudo deducir de los resultados obtenidos con los substratos no glucolisables fue que los espermatozoides de cerdo pueden utilizar eficiente mente como única fuente de energía tanto el citrato como el lactato,la utilización de estos sustratos se lleva a cabo .a través de vías energéticas controladas por la LDH, es decir, básicamente el ciclo de Krebs, siendo el ritmo de flujo asimismo estrechamente regulado por los niveles intracelulares de ATP. También se evaluó en este caso el efecto de la incubación con citrato o lactato sobre el patrón de fosforilación en residuos de tirosina. En este caso, al incubar con 10 mM de citrato o lactato se observó un aumento notable de la intensidad de todas las bandas, especialmente de la de 45Kda, si bien no aparecían cambios significativos en el patrón de bandas específico de fosforilación, este resultado indica igualmente una falta de acción específica de los sustratos sobre la funcionalidad espermática. El objetivo final de nuestro trabajo fue el diseño de cuatro fórmulas experimentales, que combinaran un monosacárido a diferentes concentraciones con un sustrato no glucolisable (citrato o lactato a diferentes concentraciones), con el objetivo primordial de estudiar el efecto que tiene estos cambios en el tipo específico de suministro energético en la conservación a largo plazo en refrigeración. La finalidad subyacente a este estudio fue la de obtener información para la obtención de un diluyente de conservación de semen refrigerado porcino que lograra sobrepasar los 7 días de conservación entre 15 y 17°C. Para evaluar la eficacia de estas cuatro formulas en la conservación de semen refrigerado de cerdo se midieron los siguientes parámetros: Los porcentajes de viabilidad y de acrosomas alterados, como indicadores del estado funcional del espermatozoide, el ritmo de formación de lactato, los Tests de Resistencia Osmótica (ORT) y de Resistencia Hiperosmótica (HRT), como las pruebas de mayor significanción para evaluar la calidad de los espermatozoide s, tal y como ha sido descrito en publicaciones previas. La conclusión final fue que un medio que contenga niveles altos de glucosa (siempre inferiores a los que contienen los diluyentes comerciales más ampliamente utilizados) y niveles relativamente bajos de lactato como fuente alternativa de energía permite una conservación de los espermatozoides porcinos a temperaturas entre 15-17°C por un tiempo mayor a lo observado incluso en diluyentes comerciales utilizados ampliamente, como el BTS. Por lo tanto, un diseño optimizado de las fuentes energéticas glucolíticas y no glucolíticas es imprescindible para la mejora de los diluyentes de semen porcino en refrigeración.

Autor: TOMÁS SANGENÍS ANNA.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Autor: RODRÍGUEZ ALVAREZ ROBERTO.
Año: 2005.
Universidad: LEÓN.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERNARIA.

Resumen: El objetivo de esta Tesis fue el diseño de un método de calificación de los caracteres de morfología corporal del ganado ovino de aptitud láctea. En una primera experiencia se estudiaron un total de diez rasgos descriptivos simples, puntuados según una escala lineal del 1 al 9, y dos medidas objetivas, peso corporal y alzada a la cruz. Se visitaron 18 rebaños del núcleo de selección de la raza Churra. Contamos con 4.732 registros de 2.809 ovejas. Las heredabilidades estimadas para los rasgos descriptivos simples se encontraron dentro del rango de 0,05 a 0,17, y las repetibilidades entre 0,12 y 0,47. Tomando en consideración dichos parámetros, así como otros aspectos prácticos de facilidad de puntuación, se seleccionaron cuatro rasgos descriptivos simples que ofrecían las mejores características para su inclusión en el sistema de calificación propuesto: la estatura (EST), los aplomos de las patas posteriores (POS), la inclinación de los talones (TAL) y la anchura de la grupa (ANC). Además, se añadió un carácter global, denominado apariencia general (APAR). En las experiencias II y III, se llevó a cabo la aplicación del sistema propuesto, primero en fase experimental y posteriormente en fase de aplicación práctica. En la experiencia II se valoraron 96 ovejas en tres visitas consecutivas. La distribución de las puntuaciones para los cinco caracteres se aproximó a la normal. La objetividad del método, ésta fue razonablemente buena, con una repetibilidad de las puntuaciones entre 0,33 y 0,46. En la experiencia III se visitaron 23 rebaños del núcleo de selección de la raza Churra. El fichero consta de 10.189 registros, correspondientes a 3.977 ovejas. Para el análisis genético de los datos se utilizó un modelo animal de repetibilidad. Los efectos fijos considerados fueron, por orden de importancia, ronda de calificación, número de parto y mes de lactación. Las heredabilidades estimadas fueron 0,19, 0,18, 0,24, 0,14 y 0,17, para los caracteres EST, POS, TAL, ANC y APAR, respectivamente. Estos valores permitirían la mejora genética de dichos caracteres por medio de la selección. El alto coeficiente de correlación múltiple entre APAR y los cuatro rasgos descriptivos simples (0,75), así como las elevadas correlaciones genéticas estimadas (en valor absoluto entre 0,51 y 0,80), permiten afirmar que a partir de los cuatro rasgos descriptivos simples es posible la obtención de un índice que recoja de forma adecuada y suficiente el mérito global de la morfología corporal. Las correlaciones genéticas entre los caracteres de morfología corporal y morfología mamaria son bajas o moderadas y en el sentido favorable. Las correlaciones genéticas estimadas entre los caracteres de producción láctea y los caracteres morfológicos fueron bajas por lo que no se esperan cambios relevantes en la morfología corporal de razas ovinas sometidas a un proceso de selección para incrementar la producción lechera y viceversa. El objetivo de esta Tesis fue el diseño de un método de calificación de los caracteres de morfología corporal del ganado ovino de aptitud láctea. En una primera experiencia se estudiaron un total de diez rasgos descriptivos simples, puntuados según una escala lineal del 1 al 9, y dos medidas objetivas, peso corporal y alzada a la cruz. Se visitaron 18 rebaños del núcleo de selección de la raza Churra. Contamos con 4.732 registros de 2.809 ovejas. Las heredabilidades estimadas para los rasgos descriptivos simples se encontraron dentro del rango de 0,05 a 0,17, y las repetibilidades entre 0,12 y 0,47. Tomando en consideración dichos parámetros, así como otros aspectos prácticos de facilidad de puntuación, se seleccionaron cuatro rasgos descriptivos simples que ofrecían las mejores características para su inclusión en el sistema de calificación propuesto: la estatura (EST), los aplomos de las patas posteriores (POS), la inclinación de los talones (TAL) y la anchura de la grupa (ANC). Además, se añadió un carácter global, denominado apariencia general (APAR). En las experiencias II y III, se llevó a cabo la aplicación del sistema propuesto, pr 8 imero en 9a2 fase experimental y posteriormente en fase de aplicación práctica. En la experiencia II se valoraron 96 ovejas en tres visitas consecutivas. La distribución de las puntuaciones para los cinco caracteres se aproximó a la normal. La objetividad del método, ésta fue razonablemente buena, con una repetibilidad de las puntuaciones entre 0,33 y 0,46. En la experiencia III se visitaron 23 rebaños del núcleo de selección de la raza Churra. El fichero consta de 10.189 registros, correspondientes a 3.977 ovejas. Para el análisis genético de los datos se utilizó un modelo animal de repetibilidad. Los efectos fijos considerados fueron, por orden de importancia, ronda de calificación, número de parto y mes de lactación. Las heredabilidades estimadas fueron 0,19, 0,18, 0,24, 0,14 y 0,17, para los caracteres EST, POS, TAL, ANC y APAR, respectivamente. Estos valores permitirían la mejora genética de dichos caracteres por medio de la selección. El alto coeficiente de correlación múltiple entre APAR y los cuatro rasgos descriptivos simples (0,75), así como las elevadas correlaciones genéticas estimadas (en valor absoluto entre 0,51 y 0,80), permiten afirmar que a partir de los cuatro rasgos descriptivos simples es posible la obtención de un índice que recoja de forma adecuada y suficiente el mérito global de la morfología corporal. Las correlaciones genéticas entre los caracteres de morfología corporal y morfología mamaria son bajas o moderadas y en el sentido favorable. Las correlaciones genéticas estimadas entre los caracteres de producción láctea y los caracteres morfológicos fueron bajas por lo que no se esperan cambios relevantes en la morfología corporal de razas ovinas sometidas a un proceso de selección para incrementar la producción lechera y viceversa.

Autor: Merchán Acedo Maria Isabel.
Año: 2006.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: Facultat de veterinària.
Centro de realización: Facultat de Vaterinària.

Resumen: El trabajo de investigación de esta tesis doctoral está enmarcado en un proyecto más amplio (AGL2001-3068 y AGL2005-07624) cuyo principal objetivo es identificar cuál es el gen mayor que determina las diferencias observadas en el carácter tamaño de camada en dos líneas de conejo seleccionadas divergentemente para capacidad uterina (CU). Para ello se ha creado una población F2 a partir del cruce experimental de 16 conejos (3 machos y 13 hembras) de las líneas seleccionadas a favor del carácter capacidad uterina (CU+) y de 8 conejos (3 machos y 5 hembras) de las líneas seleccionadas en contra del carácter capacidad uterina (CU-). En esta tesis se exponen los resultados obtenidos a partir del análisis de 5 genes candidatos fisiológicos y el correspondiente estudio de asociación de 3 de ellos con los diferentes componentes del carácter tamaño de camada. También se muestra el resultado del análisis de ESTs realizado a partir de genotecas de ovario, oviducto y útero de conejo con el fin de caracterizar la expresión génica de estos tejidos y determinar las secuencias de genes todavía no descritas en conejo. El gen uteroglobina fue seleccionado porque codifica el principal componente proteico de la secreción uterina de conejo y por su potencial papel fisiológico en la implantación. Hemos secuenciado un fragmento de 3703 pb que incluye parte de la región promotora, los 3 exones con sus respectivos intrones y parte de la región 3' flanqueante. Se han identificado 6 SNPs en la región promotora del gen que estaban co-segregando en 2 haplotipos en las líneas CU+ y CU-, pero que no parecen estar asociadas a las líneas porque éstas no presentan frecuencias alélicas diferentes. El gen receptor de progesterona media los efectos de la progesterona, que interviene en la ovulación, facilita la implantación y el mantenimiento de la gestación, promueve el desarrollo de la glándula mamaria y regula el comportamiento sexual. Se han secuenciado 3702 pb que incluían parte del promotor, la región 5'UTR, casi toda la región codificante y la región 3'UTR. Se han identificado 5 SNPs: 1 SNP silencioso en el exón 7, 1 SNP en el promotor y 3 en la región 5'UTR que co-segregan en dos haplotipos en las líneas CU+ y CU- con frecuencias diferentes. El estudio de asociación realizado en la F2 del cruce CU+ x CU- entre el SNP del promotor y los caracteres reproductivos reveló un efecto significativo sobre Nacidos Totales y Nacidos Vivos, con lo que el gen PGR podría ser el gen mayor responsable de las diferencias entre las líneas CU+ y CU-. Este SNP está segregando en cuatro líneas especializadas de conejos utilizadas para generar poblaciones comerciales. El gen IGF1 fue seleccionado en base a los resultados de experimentos realizados in vivo e in vitro: los ratones knockout para este gen mostraron que el IGF1 era esencial para el correcto desarrollo embrionario y los estudios realizados con embriones pre-implantacionales de humano y conejo revelaron que el IGF1 estimulaba la proliferación celular, promovía el desarrollo embrionario y prevenía la apoptosis. Se ha secuenciado la región codificante de la forma A del ARNm del gen IGF1 de conejo (406 pb) pero no se ha encontrado ninguna variante nucleotídica entre los animales de las líneas CU+ y CU-. El gen oviductina codifica una proteína que se sintetiza en el oviducto de los mamíferos principalmente durante el estro, la fecundación y el desarrollo embrionario temprano, y que interactúa con ovocitos, espermatozoides y embriones oviductales y uterinos. A pesar de que se desconoce su función biológica, se cree que tiene un efecto positivo sobre la capacitación, motilidad y viabilidad del esperma, la fecundación y el desarrollo embrionario temprano. Se ha determinado la estructura del gen OVGP1 de conejo, que se extiende unas 13 kb y es similar a la descrita en otras especies, y se ha estudiado la expresión génica. El mensajero se transcribe principalmente en oviducto, pero también en ovario y útero, y a un nivel muy inferior incluso en tejidos no reproductivos. Su expresión en oviducto no parece variar significativamente durante la gestación temprana, y tampoco entre los animales de ambas líneas, al menos a las 62 h post-monta. 8 Hemos am d7e plificado y secuenciado parcialmente el extremo 5' del gen (promotor, exón 1 e intrón 1) y el ARNm, y hemos identificado 21 posiciones polimórficas que están co-segregando en 3 haplotipos en las líneas CU+ y CU-. De los 11 SNPs presentes en el mensajero, los SNPs G/C12903 y C/G12944 del exón 11 determinan dos cambios aminoacídicos: Gly/Ala y Arg/Gly, respectivamente. El resultado del estudio de asociación entre el genotipo de un microsatélite trialélico presente en el promotor y los caracteres reproductivos reveló un efecto significativo sobre los caracteres Nacidos Totales y Nacidos Vivos. El estudio de asociación entre el SNP C/G12944 y los caracteres reproductivos mostró un efecto significativo en Nacidos Vivos y Supervivencia Embrionaria. A pesar de que estos resultados sugieren que el gen OVGP1 podría ser un gen mayor para algunos de los componentes del tamaño de camada, no parece ser el gen responsable de las diferencias entre las líneas ya que los alelos favorables se encuentran en la línea CU-. El gen TIMP1 fue seleccionado porque codifica una proteína que interviene en diversos procesos reproductivos (la ovulación, el desarrollo embrionario, la implantación de blastocitos, la dilatación cervical, el ciclo endometrial y la involución uterina post-parto) e inhibe la apoptosis, promueve la esteroidogénesis y el crecimiento y supervivencia celular. Además, en estudios previos realizados por nuestro grupo se observaron diferencias significativas entre las líneas CU+ y CU- en el nivel de expresión génica de TIMP1 en muestras de oviducto tomadas a las 62h post-monta, siendo superior en la línea CU+. Hemos determinado la secuencia del promotor del gen TIMP1 de conejo y hemos encontrado un SNP segregando en las 2 líneas. El estudio de asociación entre el SNP y los caracteres reproductivos indica un efecto significativo sobre el número de Embriones Implantados, lo que sugiere que el gen TIMP1 podría ser un gen mayor para la implantación. Finalmente, hemos generado genotecas de ADNc a partir de muestras de ovario, oviducto y útero de conejo tomadas a 5 h, 62 h y 5 días post-monta, respectivamente. Hemos aislado y secuenciado 623 clones, de los cuales 466 fueron clasificados como válidos, es decir, tenían secuencias de buena calidad superior o igual a 100 pb y no correspondían a tránscritos de ADN mitocondrial. Del total de EST válidos, 386 correspondían a diferentes ARNm, de los cuales 36 no habían sido previamente descritos, 48 presentaban similitud con secuencias previamente descritas pero no anotadas, y los 302 restantes presentaban similitud con secuencias anotadas pero que en su mayoría (262) no habían sido descritas en conejo. Este resultado es un reflejo del desarrollo tardío de la genómica del conejo, en comparación con otras especies.