MICROBIOLOGIA VETERINARIA

Autor: LACOMBE ANTONELI ÁNGELA.
Año: 2003.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Autor: BAU PUIG MARTA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAT DE VETERINÀRIA.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: En la presente Memoria de Tesis Doctoral se ha estudiado la micobiota de la uva en diferentes períodos de maduración, con el objetivo de identificar las especies ocratoxígenas presentes. Para ello se han muestreado 7 viñedos distintos, situados principalmente en la costa Mediterránea española, durante los años 2001,2002 y 2003. Asimismo, se ha analizado la capacidad de producir ocratoxina A de las cepas potencialmente productoras aisladas en este muestreo. Por otro lado, se han caracterizado a nivel molecular 226 cepas del género Aspergillus sección Nigri potencialmente ocratoxígenas: 53 cepas pertenecientes a la especie A.carbonarius y 173 cepas pertenecientes al agregado A.niger. Todas las cepas del estudio molecular son aislamiento de uva de distintos orígenes geográficos: España, Francia, Grecia, Israel, Italia y Portugal. La micobiota predomiante de la uva de los viñedos españoles muestreados perteneció a los géneros Alternaria, Cladosporium y Aspergillus, mientras que el género Penicillim representó menos del 3% de los aislamientos. La elevada incidencia de Alternaria spp. Y Cladosporium spp., en los primeros períodos de muestreo decreció con la maduración de la uva, mientras la presencia de Aspergiullus spp., incrementó significativamente. En todos los casos, se encontraron diferencias significativas en la incidencia de estos géneros en cada período de muestreo. Durante los tres años de muestreo, se aislaron de las uvas un total de 1812 cepas de Aspergillus spp., de entre las cuáles solamente 13 fueron identificadas como A.ochraceus, mientras que 1423 se identificaron como pertenecientes al agregado A. Niger, y 226 como A.carbonarius. El único aislamiento identificado como P.verrucosum entre las 214 cepas de Penicillium spp.aisladas mostró la capacidad de producir citrinina, pero no OA. Los aislamientos pertenecientes a Aspergillus sección Nigri represenarona alrededor del 90% del total de cepas del género aisladas. Aunque se presentaron en todos los períodos de muestreo, la presencia de las especies del agregado A.niger y de A.caronarius fue significativamente superior en la vendimia. Por otra parte, el número de aislamien tos en el medio DRBC superior que en MEA,si bien estas diferencias no resultaron significativas. Las pepetias de uva analizadas no presentaron contaminación fúngica, por lo tanto se asume que la contaminación con hongos productores de OA en la uva proviene de la superficie del fruto. En cuanto a los resultados obtenidos en el estudio de producción de OA de las cepas aisladas de viñedos españoles, se ha evidenciado la importante contribución de A.carbonarius en la contaminación por OA en uva y por tanto, en el vino. Esta afirmación se deriva no sólo de la elevada incidencia que presenta esta especie en las uvas, especialmente en la vendimia, sino también del porcentaje de cepas productoras, un 100% en este estudio. El rango de producción de OA en esta especie fue de 0,06-477 ug OA/g de medio de cultivo. En cuánto a las otras especies de Aspergillus sección Nigri aisladas, solamente el 0,7% de los aislamientos del agregado A.niger resultaron ser ocratoxígenos, en un rango de 0,05-231 ug OA/g de medio de cultivo, mientras que ninguno de los aislamientos uniseriados produjeron OA. También se detectó la producción de OA por otras especies de Aspergillus no pertenecientes a la sección Nigri. Así, 7 de los 13 aislamientos de A.ochraceus, y 3 de los 6 de A.mellus produjeron OA. También los 3 aislamientos de A.ostianus y los 6 de A.aliaceus resultaron productores. Algunas de estas especies producen OA en grandes cantidades, pero su baja incidencia en la uva hace que la importancia como fuentes de contaminación sea escasa. En relación 8 al estud 6fb io molecular de A.carbonarius, se han caracterizado mediante RAPD y secuenciación de la región ITS-5.8S del rDNA 53 cepas aisladas de uva de diferentes paises europeos. Cuarenta y nueve de las cepas presentaron un patrón de RAPD muy similar y la secuencia de la región ITS-5.8S prácticamente idéntica. Todas estas cepas produjeron OA en distintas cantidades. Las 4 cepas restantes mostraron un patrón de RAPD diferente y la secuencia de la región ITS-5.8S distinta a las demás, además de ser las únicas cepas no productoras de OA. Estos aislamientos podrían representar una nueva especie dentro de la sección Nigri. Por otra parte, en el estudio molecular del agregado A.niger se han caracterizado 173 cepas procedentes de distintos orígenes geográficos, mediante una técnica de RFLP de la región ITS-5.8S del rDNA. Todas las cepas agruparon en los 2 patrones de RFLP descritos previamente: tipo N (43% de las cepas) y tipo T (57% de las cepas). Se detectó la producción de OA en 20 de las 173 cepas (11,6%). Todas las cepas ocratoxígenas mostraron el patrón tipo N.

Autor: MARTÍNEZ PULGARÍN SUSANA.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: S. aureus es un microorganismo ubicuo causante de diversas enfermedades tanto en el hombre como en los animales domésticos. En medicina veterinaria destaca principalmente por su implicación en las infecciones intramamarias, que ocasionan importantisimas pérdidas económicas en la producción bovina, ovina y caprina. En los últimos años se ha puesto de manifiesto que S. aureus es capaz de intemalizarse, sobrevivir y, en ocasiones, multiplicarse en diferentes tipos celulares, incluidas células fagociticas, pudiendo contribuir este hecho a la persistencia de la infección en el organismo al proteger a la bacteria de la actividad del sistema inmune y de los tratamientos antibióticos y facilitar su diseminación. Esta supervivencia intracelular puede estar detellllinada por la capacidad de S. aureus para hacer frente a la acción bactericida derivada del metabolismo oxidativo de las células eucariotas. En bacterias como M. tuberculosis, C. jejuni y H. pylori se ha demostrado que la catalasa, una enzima responsable de la degradación del peróxido de hidrógeno generado durante este metabolismo en agua y oxígeno molecular, es un factor esencial para su supervivencia en elinterior de diversos tipos celulares, sin embargo, en S. aureus no se ha determinado con precisión hasta la fecha el posible papel de esta enzima en su patogénesis. Igualmente, la beta-toxina, una enzima que actúa degradando la esfingomielina presente en las membranas celulares, podria ser importante durante el ciclo de vida intracelular de S. aureus, participando, al igual que otras esfingomielinasas bacterianas, en la ruptura de la vacuola fagocitica, y posterior liberación de la bacteria al citoplasma de la célula infectada, y en la inducción de apoptosis celular a través de la liberación de ceramida. No obstante, la posible contribución de la beta-toxina a la patogénesis de S. aureus no se ha demostrado concluyentemente hasta la fecha. Basándonos en estos hechos, el objetivo principal que se planteó para esta Tesis Doctoral fue detellllinar el posible papel de la catalasa y de la beta-toxina, asi como del efecto combinado de ambas, en la patogénesis de S. aureus. Para ello se construyeron mutantes simples por delección de los genes katA (catalasa negativo) y hlb (beta-toxina negativo) y un mutante doble por delección de ambos genes a partir de una cepa de S. aureus, la 2386, que habia sido aislada de un caso clinico de mamitis en ganado bovino, y se comparó el comportamiento de los mutantes con el de la cepa parental utilizando diversos modelos biológicos. Concretamente se estudió su capacidad de supervivencia intracelular en la línea macrofágica murina J774A.1 y en la linca epitclialmamaria bovina MAC-T y su virulencia en un modelo murino de infección experimental, mediante la estimación de la DLSO. En los ensayos de supervivencia intracelular en la linea celular J774A, l no se encontraron diferencias estadisticamente significativas atribuibles a la catalasa o a la beta-toxina. En la linea celular MAC- T, sin embargo, la ausencia de actividad catalasa afectó de fom1a significativa a la proliferación de la bacteria en las primeras horas postinfección. De este resultado se deduce que la catalasa promueve la proliferación intracelular de S. aureus en células epiteliales mamarias bovinas, contribuyendo a la defensa de la bacteria durante las primeras horas postinfección, pero no influye significativamente en la supervivencia de S. aureus en el interior de células macrofágicas murinas, revelando la existencia de diferencias en el peso relativo del sistema citotóxico oxigeno-dependiente en la actividad bactericida de estos dos tipos celulares. En la línea celular MAC-T se observaron, también, diferencias significativas a favor del mutante beta-toxina negativo en la persistencia intracelular de la bacteria pero no en su proliferación. La beta-toxina, por tanto, no juega un papel relevante en la proliferación intracelular de S. aureus en células epiteliales mamarias bovinas, presentando, sin embargo, un ligero efecto sobre la persistencia en estas células que 8 no se p 6d8 roduce en las células macrofugicas murinas, lo que podria estar relacionado con la diferente composición en esfingomielina de estos dos tipos celulares. Finalmente, en los estudios realizados con el doble mutante se hallaron diferencias estadisticamente significativas a favor de este en las dos lineas celulares utilizadas. Estos estudios muestran que la catalasa y la beta-toxina actúan de forma sinérgica durante el ciclo de vida intracelular de S. aureus, de manera que la carencia simultánea de ambas enzimas se traduce en un retraso en la proliferación intracelular de S. aureus en células epiteliales mamarias bovinas y en un notable incremento en su persistencia en los dos tipos celulares estudiados, esto último como consecuencia, posiblemente, de una menor patogenicidad para la célula. Los ensayos de vi1111enciaen el modelo murino (DLSO) indican que la catalasa y la beta-toxina, por si solas. no JUégan un papel decisivo en la virulencia de S. aureus, sin embargo, el efecto combinado de ambas enzimasjuega un papel detellninante en la virulencia de la bacteria en este modelo. La mayor permisividad de replicación y persistencia intracelulares, así como la menor patogenicidad, mostradas por el doble mutante, le convierten en un buen candidato para su posible uso como vacuna atenuada frente a los procesos causados por S, aureus.

Autor: DE LA TORRE MARTÍNEZ MARIA EUGÈNIA.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAT DE VETERINARIA, UAB.
Centro de realización: FACULTAT DE VETERINARIA, UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA.

Resumen: La salmonelosis es la toxiinfección alimentaria transmitida a través de productos y subproductos de origen animal más importante en los países desarrollados. A esto hay que añadir la aparición de cepas de Salmonella multirresistentes debido principalmente al abuso de antimicrobianos en las explotaciones animales. Estos hechos motivan la necesidad del estudio y vigilancia epidemiológica de Salmonella en todo el mundo. Para ello se requiere de métodos de identificación y caracterización adecuados, que puedan ser útiles para establecer relaciones de similitud entre las cepas aisladas y detectar así, el origen de brotes epidémicos, permitiendo realizar un seguimiento comparable a nivel mundial. Cuando en el año 1997 se aisló en España por vez primera la cepa monofásica de Salmonella con fórmula antigénica (4,5,12:i:-), se llevaron a cabo diversos estudios epidemiológicos con el fin de establecer su posible origen. Este "nuevo serotipo" presentaba con frecuencia un perfil de multirresistencia R-ACSSuT-GSxT, con fagotipo U302 en más del 55% de los casos. Mediante el uso de distintos métodos de caracterización (la determinación del perfil de restricción mediante electroforesis en campo pulsado (PFGE), el perfil plasmídico, el de antibiorresistencia y el fagotipo) determinamos la posible relación genética de 48 cepas de Salmonella enterica subesp. enterica procedentes de muestras de cerdo en Cataluña, aisladas en nuestro laboratorio durante el periodo comprendido entre 1998 y 2000. Veintitrés de estas cepas pertenecían a S. enterica (4,5,12:i:-), 24 a S. enterica serotipo Typhimurium (4,5,12:i:1,2) y una cepa a S. enterica (4,5,12:-:-). Después de combinar los perfiles de PFGE, obtenidos con el uso de dos enzimas de restricción distintas (XbaI y BlnI), se observó que las 48 cepas se agrupaban en 7 patrones de restricción combinados (perfil XB). Los 23 aislamientos del serotipo (4,5,12:i:-) y 10 cepas del serotipo Typhimurium presentaban un mismo patrón. Tres de estas 10 cepas con fagotipo U302 aisladas durante los primeros años del estudio, compartían a su vez el perfil plasmídico y patrón de multirresistencia característico de la cepa monofásica. A partir del análisis de las relaciones entre las cepas del estudio, concluimos que el nuevo serotipo monofásico era en realidad una variedad monofásica del serotipo Typhimurium U302. Un factor a tener en cuenta en los estudios epidemiológicos y de brotes epidémicos, es el tiempo necesario para establecer relaciones entre las cepas aisladas de muestras clínicas y determinar así, el posible origen de las mismas. Una herramienta que establezca de forma preliminar y con cierto grado de fiabilidad estas relaciones sería de gran ayuda. El perfil bioquímico clásico para la caracterización e identificación de cepas de Salmonella, tiene sólo en cuenta los resultados positivos o negativos frente a substratos concretos, utilizados para la identificación de las distintas subespecies del género. Con nuestro segundo estudio determinamos relaciones entre 135 aislamientos de Salmonella pertenecientes a varios serotipos, incluyendo cepas de la variedad monofásica, mediante el uso de datos de cinéticas bioquímicas de las pruebas utilizadas para la identificación de subespecies de Salmonella. El biotipazo permitió obtener seis grandes grupos que incluían al 94% del total de cepas (n=127). El porcentaje de similitud dentro de un mismo grupo era mayor o igual al 95%. En algunos de los grupos se observaron no sólo cepas pertenecientes a un mismo serotipo sino también variedades fenotípicas de éstos. Las cepas restantes (n=8), constituían grupos con un único aislamiento. Esto sug 8 iere que 3a0 los datos de las cinéticas de las reacciones metabólicas utilizadas para identificar y biotipar a las subespecies de Salmonella enterica, pueden utilizarse para determinar de forma preliminar relaciones entre aislamientos en un periodo corto de tiempo.

Autor: ALVAREZ GONZALEZ BEATRIZ.
Año: 2005.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El patógeno de salmónidos Flavobacterium psychrophilum es el causante de la enfermedad del agua fría. Esta patología causa importantes pérdidas económicas en las piscifactorías, y no se dispone de un sistema de profilaxis eficaz. A pesar de la gran importancia de esta enfermedad, se conoce muy poco sobre los mecanismos de patogenicidad de F. psychrophilum. En el presente trabajo se ha diseñado un nuevo medio de cultivo sólido para mejorar la recuperación de células viables a partir del cultivo líquido, y se han desarrollado una serie de métodos como la conjugación, transformación y vectores de expresión, que permiten la manipulación genética de F. psychrophilum. Aplicando la tecnología desarrollada se han obtenido una serie de mutantes en caracteres descritos como implicados en la virulencia de F. psychrophilum (motilidad, actividad proteolítica extracelular y limitación de crecimiento en ausencia de hierro). De entre estos mutantes, en la presente memoria se estudió el denominado FP523, que presentó simultáneamente defectos en los tres rasgos fenotípicos anteriormente señalados y una disminución en su virulencia. Además, este mutante mostró también alteraciones en el crecimiento y un aumento a la sensibilidad al DTT y, al contrario que la cepa parental, fue capaz de formar biofilm. El gen interrumpido en este mutante, denominado tlpB, codificaba una tioldisulfuro oxidorreductasa implicada en la reducción de puentes disulfuro en las proteínas periplásmicas.

Autor: VIDAL GALLEGO ANA BELEN.
Año: 2005.
Universidad: LEÓN.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: El objetivo principal de esta tesis fue determinar la frecuencia de aislamiento de Salmonella en el ganado porcino, evaluar las herramientas disponibles para su diagnóstico, identificación y caracterización, así como esclarecer los aspectos relacionados con su epidemiología, necesarios a la hora de establecer estrategias eficaces de vigilancia y control de Salmonella en los sistemas de producción porcina. Una primera parte del estudio se llevó a cabo en cerdos de matadero. Se monitorizaron diferentes lotes de cerdos en la fase final de cebo en dos momentos diferentes, en la granja antes de su salida al matadero y tras el sacrificio. El estudio constó de un análisis bacteriológico de diferentes tipos de muestras, así como de un análisis serológico. Se evaluó la utilidad de un Mix-ELISA para la detección de anticuerpos frente a Salmonella y se determinó en qué medida los resultados serológicos reflejan la presencia de Salmonella en los lotes estudiados. Finalmente, se determinaron los factores y las fases de la producción asociadas con la presencia de Salmonella en los cerdos tras el sacrificio. La segunda parte de esta tesis se llevó a cabo sobre cerdos enfermos con el fin de determinar la frecuencia de detección, así como los serotipos y fagotipos implicados. En una tercera parte del trabajo se determinó la variabilidad genética de los aislados de diferentes fagotipos de S. Typhimurkium y de S. 4, 5, 12: i:- para lo cual se utilizaron dos técnicas moleculares: la determinación del perfil de plásmidos y la electroforesis en campo pulsado (PFGE) del ADN previamente digerido con las enzimas XbaI y BlnI. Finalmente, en la cuarta y última parte de la tesis doctoral, se estudió la resistencia a diferentes antimicrobianos, en aislados de diferentes serotipos y fagotipos de Salmonella procedentes de cerdos sanos y enfermos. Los resultados obtenidos en esta tesis pone de manifiesto la importancia del ganado porcino como reservorio de serotipos de Salmonella frecuentemente resistentes a los antimicrobianos. Estos aislados resistentes son capaces de causar salmonelosis en el hombre. Por esta y otras razones, sería importante llevar a cabo medidas de control eficaces que pudieran reducir la prevalencia de la infección por Salmonella y el desarrollo de resistencias bacterianas en las explotaciones porcinas. Estas medidas contribuirían a una disminución de la entrada de productos del cerdo contaminados con Salmonella en la cadena alimentaria

Autor: MENENDEZ GONZALEZ AURORA.
Año: 2006.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.

Resumen: Los mecanismos de patogenicidad de Lactococcus garvieae, agente causal de la lactococosis en diversas especies de peces de agua dulce, salada y salobre, son aún poco conocidos. Para abordar su estudio, en el presente trabajo se ha utilizado la técnica denominada mutagenesis de marcaje (Signature tagged mutageneiss, STM). Para ello, fue necesario desarrollar, todo un conjunto de técnicas genéticas en este microorganismo como la transformaicón, la interrupción génica, la mutagénesis mediante transposición, ect. A continuación, y mediante la aplicación de STM, se ha podido identificar un conjunto de mutante atenuados en su virulencia cuyos genes interrumpidos han sido identificados y entre los que se encuentran genes relacionados con el metabolismo, genes implicados en el transporte y genes reguladores. Algunos de estos mutantes hans ido estudiados en más profundidad tanto in vitro como en el propio hospedador y los resultados obtenidios han permitido establecer algunos de los mecanismos específicos de patogenicidad de L.garvieae.