REPRODUCCION ANIMAL

Autor: URDANETA VARGAS AIXA EFRAILDA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERIANARIA.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: Con el fin de mejorar la producción in vitro de embriones (PIVE) desde ovocitos de cabra perpúber, fueron diseñados tres estudios en esta investigación. El objetivo del primer estudio fue determinar en ovocitos seleccionados mediante el test azul de cresol brillante (BCB), el efecto de la adición de glutatión (GSH) solo o en combinación con glusoca al medio de cultivo in vitro (CIV), sobre el desarrollo embrionario de ovocitos de cabra perpúber. Los ovocitos fueron expuestos al test de BCB y fueron clasificados como: ovocitos con citoplasma azul (BCB+) y ovocitos sin el citoplasma azul (BCB-). Los ovocitos BCB+ mostraron mayor porcentaje de maduración nuclear que los ovocitos BCB- y grupo control (82,6%, 55,7% y 74,7% respectivamente). El porcentaje de ovocitos poliespérmicos fue mayor en ovocitos BCB- que en los BCB+. La suplementación del medio de cultivo (CIV) con 1 mM de GSH, no afectó el desarrollo embrionario, pero el porcentaje de embriones totales desarrollados después del cultivo fue mayor en ovocitos BCB+ que en los BCB-, independientemente de la suplementación con GSH. La adición de glucosa, sola o con GSH no afectó el desarrollo embrionario. La finalidad del segundo estudio era evaluar el efecto de agregar diferentes concentraciones de cisteamina (100uM, 200uM ó 400uM) al medio d eMIV y al medio de CIV (50uM o 100uM) sobre el desarrollo embrionario de ovocitos de cabra perpúber seleccionados por el test BCB. La adición de 400 uM de cisteamina al medio MIV mejoró la fecundación normal y desarrollo embrionario de ovocitos BCB- a los mismos niveles de los ovocitos BCB+. Las proporciones de mórulas mas blastocistos desarrollados no fueron afectados por los tratamientos. Finalmente, fue estudiado el efecto de la adición de cisteamina (400uM) para el medio de MIV, glutation (1mM) al medio FIV e ionomicina al medio de capacitación espermática. Este tratamiento mejoró la fecundación normal, cigotos con pronúcleos masculinos y el desarrollo embrionario de ovocitos de cabra prepuber, sin embargo no mejoró el desarrollo de blastocistos.

Autor: ANDRADE MARTINS DE CARVALHO BESSA ANA CELESTE.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID [www.ucm.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: El objetivo de este estudio fue valorar los efectos sobre la motilidad, integridad de la membrana plasmática y acrosomal, grado de capacitación, reacción acrosómica y actividad mitocondrial, presenta la incorporación de distintos crioprotectores a los diluyentes de refrigeración'y congelación del semen canino. Para este fin se realizaron 4 experimentos, en los que los espermatozoides preservados por refrigeración y congelación fueron analizados mediante métodos convencionales y, dependiendo del experimento, pruebas complementarias de valoración de la funcionalidad del espermatozoide, incluyéndose: -motilidad determinada mediante el sistema informático SCA@2002, -integridad de la membrana plasmática determinada por test de endósmosis o por tinción con el fluoroeromo yoduro de propididum (PI) y tinciones de eosina,-integridad del acrosoma determinada mediante la tinción específica Spennac@ o las lectinas fluorescentes de Pisum sativum (PSA) y de Arachis hypogea (PNA), -cstado de capacitación con elortetraciclina (CTC), -actividad mitocondrial por tineión con Rodaminal23 (R123) y -capacidad de experimentar reacción acrosómica mediante incubación con calcio ionóforo A23187 y leetinas fluorescentes. Los resultados obtenidos para cada variable se eon'elacionaron entre si en cada experimento. Para ejecutar estos experimentos, se utilizaron pools de semen obtenidos a partir de la fracción espennática de distintos eyaeulados provenientes de 19 penos entre los 2 y 7 años de edad, de distintas razas y con fertilidad anterior probada. La selección de los eyaeulados se realizó teniendo en cuenta una motilidad total superior al 80%, motilidad progresiva superior al 70% y el porcentaje de anomalías morfológicas inferior al 20%. En el experimento I se valoró la incorporación de aminoácidos al diluyente de refrigeración Tris-fructosa-ácido cítrico y 20% de yema (medio control) y se propuso la rcduceión de la concentración de yema. Los resultados sugieran que la suplementación con taurina a 30 y 5OmM proporciona solo ligeras mejoras de la motilidad espem1átiea y que la adición de 30mM de Taurina ha permitido rebajar al S'10el porcentaje de yema, sin diferencias significativas con el medio control hasta el dia 7. Solamente se han observado diferencias significativas entre los diluyentes que contienen un 20 y un 10% de cima, para la motilidad total estimada visualmente en los dias 2 y 3 (p menor O,OO1). Se han obtenido altas y significativas congelaciones catre los resultados de motilidad estimada visualmente y mediante análisis informático, al igual que con el test de hipo-ósmosis (r entre 0,703 y 0,976, p mayor O,Ol). El marcaje con CTC permitió establecer diferencias estadisticas para el patrón AR de espermatozoides refrigerados en diluyentes con 20% de yema y O,30 YSOmM de Taurina, siendo el diluyente con 30mM el que induce mayor porcentaje en menor tiempo (14,67%, cn el día 3, p=0,007). El segundo experimento se realizó para valorar la capacidad del etilénglieol como eríoprotector en el diluyente de congelación del espermatozoide canino, alternativamente o asociado al glicerol o la Pasta Equex@. La utilización de etilénglieol a14% presenta resultados similares de motilidad a los obtenidos con 8% de glicerol; sin embargo, resulta perjudicial cuando se emplea al 8% (p mayor O,O5). La adición de Equex STM Paste@ a un diluyente con S% de etilénglicol mejora los resultados frente a14% de etilénglicol o el 8% de glicerol (p mayor O,O5). El uso de etilénglicol no obtuvo mejores resultados que el diluyente Uppsala-Equex (con S% dc Glicerol y O,5% de Equex-STM Paste), que pennite mayor supervivencia celular post-descongelac 8 ión. En 839 el tercer experimento se compararon los resultados de evaluación de la actividad mitoeondrial espelmátiea, realizada mediante eitometda de flujo tras tinción con RI23 asociada a PI, con los de valoración de la vitalidad por tineión con eosina-nigrosina y de la motilidad estimada subjetivamente; pudiéndose establecer altas eonelaeioncs entre ellos (1'de 0,992 a 0,999, p mayor O,O1). En el cuarto experimento se estudió el impacto de la suplementación del diluyente de congelación Uppsala-Equex con los aminoácidos taurina o hipotaurina a O,25, 5Oy 75mM en distintos aspectos de las funciones espelll1áticas. No se obtuvo influencia significativa en la motilidad espennátiea; sin embargo, la adición de 25mM de hipotaurina presentó un valor significativamente menor del factor ALH tras 2h en incubación a 38°C (p=0,021), mientras que la adición de 5OmM de hipDtaurina dio lugar a un mayor %, de células espontáneamcnte reaccionadas (PI-PSA+) inmediatamente a la descongelación y tras 1:30h en incubación a 38°C (p=O,OOIy 0,004, respectivamente). Por otra parte, la adición de 2,5 y 10 1Mde calcio ionóforo al semen canino descongelado e incubado durante 20min en CCM a 38°C permitió inducir un incremento de la reacción aerosómica vcrdadera (PI-PNA+) tras S, IS y 30 minutos mas en ineubaeión, frente a Ou 1M(p mayor O,OO1). Fue posible ohservar diferencias (p=O,OS)en el porcentaje de reacciones acrosómicas a los ISmin de incubación con 2,5¡1Mde ionóforo; alcanzando el diluyente con 5OmM-Taurina mayor porcentaje, frente a los diluycntes con 7SmM-Taurina, 25 y 50mM-Hipotaurina y sin diferencias frente al diluyente control. Estos diluyentes presentaban entre el 19 y 22% menos RA que el control.

Autor: FERNANDEZ SANTOS MARIA DEL ROCIO.
Año: 2005.
Universidad: CASTILLA-LA MANCHA [www.uclm.es].
Centro de lectura: E.T.S. DE ING. AGRO. DE ALBACETE.
Centro de realización: INST. DE INVES. EN REC. CINEG (IREC).

Resumen: El protocolo para la congelación de muestras espermáticas epididimarias utilizado, hasta el momento, ha sido prácticamente el mismo que para las muestras seminales procedentes de eyaculados de animales domésticos. El objetivo general de este trabajo se orientó hacia la adaptación de estos protocolos para su uso con muestras espermáticas epididimarias de ciervo ibérico con objeto de mejorar la eficacia de los mismos para este tipo de muestras. En primer lugar, estudiamos el efecto combinado de dos variables, velocidad de enfriamiento y concentración de yema de huevo en el diluyente sobre la supervivencia de los espermatozoides epididimarios refrigerados. Una vez conocidos los efectos de la yema de huevo sobre los espermatozoides epididimarios en la refrigeración, decidimos estudiar los mismos en la etapa de criopreservación. Con este objetivo, por un lado, se diseñó un experimento para determinar qué concentración y que método de preparación de la yema de huevo (centrifugada vs completa) eran los más adecuados para la congelación de los espermatozoides epididimarios de ciervo. Por otro lado, se estudió de forma conjunta los efectos de tres variables sobre la congelabilidad de las muestras espermáticas epididimarias de ciervo ibérico: concentración de yema clarificada concentración final de glicerol y velocidad de enfriamiento desde 22 ºC a 5 ºC. Seguidamente, estudiamos la influencia de varios crioprotectores así como la temperatura de adición del crioprotector (22 °C -temperatura ambiente- o 5 °C) sobre la congelabilidad de este tipo de espermatozoides. Siguiendo con nuestro objetivo de optimizar el protocolo de congelación para las muestras espermáticas epididimarias de ciervo, llevamos a cabo otros dos experimentos. El primero, diseñado para la determinación de la osmolalidad más idónea del diluyente (Tris-citrato-fructosa); y el segundo, para el estudio de los efectos de la adición de azúcares al diluyente de congelación. Finalmente, se estudió el posible efecto protector de diferentes antioxidantes durante la criopreservación de los espermatozoides epididimarios de ciervo ibérico. Tras los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral, proponemos que la congelación de los espermatozoides epididimarios de ciervo ibérico se realice utilizando un diluyente Tris-citrato-fructosa suplementado con un 20% de yema clarificada y una concentración final de glicerol de un 6%. El glicerol puede añadirse a temperatura ambiente (22 ºC), y el enfriamiento debería ser rápido (?4,2 ºC/min). Además, sugerimos la adición de antioxidantes enzimáticos al diluyente de congelación, para así proporcionar una mayor protección a las dosis congeladas.

Autor: CIUDAD LADRERO MARIA ANGELES.
Año: 2005.
Universidad: ZARAGOZA [www.unizar.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: El objetivo principal del trabajo ha sido determinar los factores que rodean a la IA ovina de la raza Rasa Aragonesa, en el seno del Programa de Selección por prolificidad de la UPRA-Oviaragón, que influyen en sus resultados reproductivos. Dichos factores se han agrupado en 3 tipos: los que afectan a la propia hembra inseminada (edad, condición corporal, intervalo entre el parto anterior y la IA); los que se refieren a la propia técnica (duración del tratamiento progestativo, momento de la inseminación respecto a la preparación de las dosis seminales y respecto al fin del tratamiento progestativo, diluyente utilizado, inseminador, etc.) y los que tienen que ver con factores ligados a la explotación y manejo en la ganadería (fecundidad media de la explotación, margen bruto, experiencia del ganadero en el uso de la técnica, etc.). De estos factores, los más influyentes fueron: la edad de la oveja (mejores resultados de 2 a 3 años); el diluyente (mejores resultados con leche descremada que con Tris-tes más 6% de yema de huevo y 3% de glicerol); la edad de los sementales (mejores resultados con edades de 27 a 72 meses); la CC de las ovejas (mejores resultados con CC entre 3 y 3.5); momento de la inseminación (mejores resultados si la IA se realiza en las 5 primeras horas tras la preparación del semen y antes de las 54.75 horas tras el fin del tratamiento progestativo). Por último, se estudió el efecto de la estación sobre los resultados reproductivos de la IA, siendo estos resultados mejores entre Julio y Octubre.

Autor: CARDOZO CERQUERA JAIME ANTONIO.
Año: 2005.
Universidad: ZARAGOZA [www.unizar.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA.

Resumen: El objetivo global de esta tesis fue profundizar en el conocimiento acerca de las proteínas del plasma seminal y de la membrana plasmática del espermatozoide ovino, componentes esenciales para el adecuado funcionamiento del espermatozoide. La técnica utilizada, electroforesis bidimensional permite caracterizar mezclas complejas de proteínas, identificando cambios cualitativos y cuantitativos en respuesta de la célula a variaciones ambiéntales. La caracterización del perfil de las proteínas tanto del plasma seminal, como de la membrana plasmática del espermatozoide ovino, y su variación en respuesta a factores estacionales y a agentes estresantes, constituyeron los elementos básicos de este estudio. Los trabajos iniciales permitieron, la estandarización de los diferentes protocolos para establecer la cantidad adecuada de proteína, tanto de plasma seminal como de membrana plasmática, que junto al empleo de tampones de solubilización específicos para las distintas muestras estudiadas, permitieran la obtención de geles, con alta resolución de los puntos de proteína. El plasma seminal de los mamíferos es un fluido complejo que sirve como medio de transporte al espermatozoide desde el testículo hasta su encuentro con el ovocito (Thomas 2003), que contiene una variedad de componentes bioquímicos, algunos de ellos relativamente específicos en la regulación del funcionamiento del espermatozoide. Se han descrito importantes acciones de las proteínas del plasma seminal, en aspectos tales como la motilidad y la viabilidad de los espermatozoides del eyaculado, e igualmente en aspectos claves como la capacitación y la interacción entre los gametos. Por ello, en este trabajo se estableció un mapa referencia] de 2D de las proteínas del plasma seminal y las posibles relaciones con los porcentajes de espermas viables y mótiles, y con la concentración espermática del eyaculado. Se detectaron 252 "puntos de proteína", estableciéndose además que la gran mayoría (86%) tienen un pH ácido y están glicosiladas. Igualmente, se observó una influencia significativa de la estación (reproductiva o no-reproductiva) en la concentración de algunas de ellas, y la desaparición de unas y aparición de otras en una u otra estación. Las correlaciones positivas y/o negativas que se establecieron entre algunos puntos de proteína y las variables de calidad seminal mencionadas, sugieren que podrían interaccionar conjuntamente para asegurar un adecuado funcionamiento del espermatozoide. Los resultados de los análisis por 2D-PAGE y por inmunodetección establecieron la composición de las bandas de proteína RSVP14 y RSVP20 del plasma seminal, propuesta en estudios anteriores como capaces de proteger y/o reparar del daño ocasionado a la membrana del espermatozoide por choque térmico por frió, evidenciando que están compuestas por puntos de proteína de bajo peso molecular y pH ácido. La banda RSVP14 esta formada por seis "puntos de proteína", mientras que la banda RSVP20 esta constituida por dos puntos, posiblemente con diferente grado de glicosilación y/o fosforilación. El análisis de secuencias internas mediante secuenciación "de novo" completo la información previamente obtenida por degradación automática de Edman, y permitió concluir que RSVP14 está relacionada con la familia de las proteínas mayoritarias en el plasma seminal bovino (BSP), mientras que uno de los puntos que se corresponden con la RSVP20 no presenta homología con ninguna proteína recogida en las bases de datos de mamíferos. El análisis electroforético de las proteínas de la membrana plasmática del espermatozoide, reveló la presencia de 150 "puntos de proteína" en el mapa 2D referencial, con variaciones estacionales en la concentración de algunos puntos, así como también la presencia exclusiva de dos puntos en la estación de apareamiento, lo que podría sugerir su importancia en el proceso reproductivo. Los estudios por western blot evidenci 8 aron la 790 reacción de seis puntos con el anticuerpo generado contra la banda RSVP14 del plasma seminal, resultado que confirma que estas proteínas provienen del plasma seminal y se adsorben a la membrana del espermatozoide tal como se ha demostrado en trabajos anteriores. Finalmente, se comprobó que la criopreservación provoca variación en los perfiles de las proteínas de la membrana plasmática del espermatozoide, con pérdida de algunos puntos y aparición de otros con respecto a los mapas 2D de proteínas de semen fresco. La adición de proteínas del plasma seminal al medio de criopreservación provocó un incremento significativo en la concentración de uno de los puntos que forma parte de la banda RSVP 14 confirmando nuevamente su adsorción a la membrana del espermatozoide. En síntesis, estos estudios han pretendido contribuir mediante la técnica de 2D-PAGE, a generar conocimiento básico acerca de las principales proteínas presentes en el plasma seminal y la membrana plasmática del espermatozoide. Además, se han aportado nuevos datos acerca del efecto estacional y de agentes estresantes en el perfil electroforético de las proteínas, con el objetivo de poder establecer estrategias de manejo del espermatozoide tendiente a incrementar la eficiencia reproductiva del sistema de producción ovino.

Autor: GARCÍA TOMÀS MÓNICA.
Año: 2006.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Autor: APARICIO DONOSO INÉS MARÍA.
Año: 2006.
Universidad: EXTREMADURA [www.unex.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Cuando el espermatozoide es depositado en el tracto genital de la hembra, sufrirá una serie de cambios fisiológicos y bioquímicos que le permitirán llegar hasta el óvulo y fecundarlo. Estos cambios suponen un incremento en la motilidad, la capacitación y, finalmente, la reacción acrosómica. Aunque estas modificaciones tienen lugar in vivo, también puede conseguirse in vitro mediante el uso de un medio de incubación químicamente definido, lo cual permite estudiar las bases fisiológicas y bioquímicas que regulan estos procesos. Así, se ha demostrado que tanto la motilidad, la capacitación como la reacción acrosómica están reguladas o asociadas con cambios en el estado de fosforilación de diferentes proteínas. En la presente Tesis nos hemos propuesto los siguientes objetivos: A,- Estudiar la posible relación existente entre las vías intracelulares de señalización mediadas por fosforilación de proteínas en tirosina y el proceso de capacitación de los espermatozoides de verraco. B,- Determinar el papel de la vía intracelular de la Fosfatidilinositol 3-Quinasa (Pl3K) en la regulación de la motilidad, capacitación, reacción acrosómica y viabilidad de los espermatozoides de verraco. C,- Estudiar el posible papel de la Glucógeno Sintasa Quinasa 3 (GSK3) en la regulación de la motilidad, capacitación y reacción acrosómica de los espermatozoides de varraco. D,- Determinar la posible relación entre las vías intracelulares del AMPc/Proteína Quinasa A y de la Fosfatidilinositol 3-Quinasa/Proteína Quinasa B en la regulación de la actividad de la Glucógeno Sintasa Quinasa 3alfa y de la motilidad de los espermatozoides de verraco. Nuestros resultados nos permiten concluir que el proceso de capacitación de los espermatozoides de verraco esta parcialmente regulado por vías de señalización intracelular que implican la actuación de tirosinas quinasas y de la serina/reonina quinasa GSK3. Asimismo, la fosforilación en tirosina de una proteína de 32 kDa (denominada p32) puede ser utilizada con mayor exactitud los procesos de capacitación y reacción acrosómica de los espermatozoides de verraco. En estas células, los procesos de capacitación y pseudocapacitación inducida por choque térmico están regulados por diferentes vías de señalización intracelular. Por otra parte, la supervivencia celular de los espermatozoides de verraco está regulada, al menos en parte, por la PI3K. La motilidad de los espermatozoides de verraco está regulada de forma negativa por la PI3K y de forma positiva por la PKA. Finalmente, la GSK3alfa representa un efector común donde convergen diferentes vías de señalización intracelular que regulan la motilidad en espermatozoides de verraco.