CIENCIAS DE LA VIDA, 16

Autor: Portela Mestres Anna.
Año: 2006.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: Facultat de Biociències.
Centro de realización: Universitat Autònoma de Barcelona.

Resumen: El presente trabajo de tesis se centra en el estudio de diferentes mutantes zeste1 y en el efecto que esta mutación tiene sobre la regulación de la transcripción en diversos genes. En primer lugar se estudiaron los machos de las cepas M115 y RM115 cuya característica principal, además de ser portadores de la mutación z1, es la inserción de un elemento transponible FB-NOF en el tercer intrón de CG32795, que forma con w un par de genes head-to-tail. Para poder estudiar cual es el efecto de la inserción de FB-NOF en un entorno z1, fue necesario caracterizar en primer lugar el gen CG32795, a nivel de secuencia del mRNA y de predicción de la posible función de la proteina codificada. Se encontraron diversas variantes de splicing, tanto para su extremo 5' como para el 3', parecidas pero diferentes de las variantes predichas anteriormente. Conociendo más en profundidad este gen, nos propusimos estudiar los posibles efectos de la inserción de FB-NOF respecto a la expresión de los genes w y CG32795. Los resultados nos llevaron a un estudio más detallado de la expresión de w en diferentes partes del cuerpo, teniendo en cuenta la especificidad de tejido que la interacción zeste-white presenta. Así, vimos que el gen w no se ve afectado por la inserción de FB-NOF en su extremo 3' y que las diferencias de expresión observadas son debidas a la duplicación del Zeste Binding Site de w en un entorno z1. Sin embargo, la inserción de FB-NOF en el tercer intrón de CG32795 sí que modifica la expresión de este gen. No sólo la inserción es responsable de la alteración de la expresión de CG32795 sino también la reordenación que se produce en la cepa RM115 eliminando la copia de w original y dejando la que se duplicó en M115. La segunda parte de esta tesis consiste en el estudio de las hembras mutantes z1. Analizamos la expresión de dos genes con un ZBS (w y dpp) y observamos como se reduce la expresión de dichos genes en las hembras z1. Además, estudiando la expresión del gen CG32795 constatamos que el efecto de la interacción zeste-white es local, sin afectar a este gen aunque su extremo 5' se encuentra a tan solo 700bp del extremo 3' del gen w. La reducción de la expresión nos hizo pensar que podía ser debida a alteraciones en la estructura de la cromatina, puesto que los agregados de Zeste en los ZBS son los responsables de reclutar el complejo remodelador de la cromatina BRM, facilitando así la transcripción. Mediante un ensayo de nucleasa micrococal detectamos algunas modificaciones en el posicionamiento de nucleosomas en los ZBS de w y dpp, siendo el posicionamiento en las hembras z1 más estricto. Si el complejo BRM es el responsable de estas diferencias, pensamos que los patrones de metilación también podrían estar alterados, pues muchos factores asociados a los complejos SWI/SNF se han relacionado con actividades de regulación de la expresión mediante modificación de los mismos. Mediante el ensayo de modificación del DNA por bisulfito sódico estudiamos los patrones de metilación de cinco regiones. Sorprendentemente, el ZBS de w y de dpp, así como las regiones próximas a ellos, se encontraban hipometilados en las hembras z1. El desconocimiento general sobre la metilación en D. melanogaster nos hizo plantear cuales pueden ser las secuencias diana de la metilación en esta especie. Así realizamos un estudio estadístico sobre cuales son las dos bases anteriores y posteriores a las Cs metiladas en nuestras secuencias. Se obtuvieron diferencias en las frecuencias de cada posición y se estableció como secuencia más frecuente para ser metilada ApDp5mCpDpD. Aún así, es una secuencia muy degenerada, y se hacen necesarios estudios más profundos y amplios para confirmarla.

Autor: Cardús Figueras Anna.
Año: 2006.
Universidad: LLEIDA.
Centro de lectura: Universitat de Lleida. Departament de Medicina.
Centro de realización: Universitat de Lleida.

Resumen: La arteriosclerosis es un proceso caracterizado por el engrosamiento y endurecimiento de la pared de las arterias. Este proceso se encuentra acelerado en pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC). Además, estos pacientes sufren una disminución de la síntesis de 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) que les conduce a otras complicaciones como el hiperparatiroidismo secundario (HPT2). Por esta razón es común el uso de 1,25(OH)2D3 en el tratamiento del HPT2. El efecto de la 1,25(OH)2D3 en la calcificación de las células de músculo liso (CMLV) está bastante estudiado, pero su efecto en la proliferación no está muy claro. Analizamos el efecto de la 1,25(OH) 2D3 en la proliferación de las CMLV por incorporación de BrdU y citometría de flujo. Nuestros resultados muestran que la 1,25(OH)2D3 induce la proliferación de las CMLV de una manera dosis dependiente tanto en estado quiescente como proliferativo. El efecto de la 1,25(OH)2D3 en la proliferación se correlaciona con un incremento de expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF). Además, al inhibir la actividad de este VEGF observamos que la proliferación inducida por la 1,25(OH)2D3 se encuentra totalmente bloqueada. A partir de estos resultados analizamos la zona promotora de VEGF y observamos la presencia de 3 zonas con secuencias muy parecidas a los elementos de respuesta de la vitamina D (VDRE) presentes en los genes diana de la 1,25(OH)2D3. A partir del análisis por Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP) detectamos un VDRE en el promotor del VEGF donde el receptor de la vitamina D (VDR) se une tras el tratamiento con 1,25(OH)2D3. Luego planteamos un modelo distinto para comparar el efecto de la 1,25(OH)2D3 y el 19-nor-1,25(OH)2D2 en el proceso de proliferación y de calcificación in vitro, ex vivo e in vivo en un modelo de ratas IRC. Observamos un incremento de la proliferación en las CMLV, los anillos de arteria aorta y en los animales tratados con 1,25(OH)2D3 pero no en los tratamientos con 19-nor-1,25 (OH) 2D2.

Autor: BARRIUSO IGLESIAS MÓNICA.
Año: 2006.
Universidad: LEÓN.
Centro de lectura: FACULTA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES.

Resumen: Esta memoria recoge los resultados obtenidos en el estudio sobre la respuesta al estrés por pH en C. glutamicum, permitiendo así tener un conocimiento más amplio de promotores regulados por un cambio de pH. La importancia de este trabajo reside en el gran interés existente por el estudio de promotores regulables, ya que pueden ser utilizados biotecnológicamente para expresar a voluntad (en este caso concreto, en función del pH del cultivo) genes que sean acoplados a estos promotores. Así, se describe por primera vez a Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como un microorganismo alcalófilo, apoyado por un fenómeno de adaptacion al pH observado cuando se utilizan cultivos a pH 9.0 como inóculos para iniciar cultivos a pH 10.0. En el proteoma citoplasmático y de membrana de C.glutamicum WT a diferentes concidiciones de pH se apreció cómo 21 proteínas presentaban variación en su expresión. Se ha observado la existencia de un posible mecanismo de regulación a pH básico en el que estarían involucrados la cadena respiratoria y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. De entre las proteínas identificadas se eligió el operón de la F0F1-ATP sintasa de membrana, como candidato para estudiar la inducción de su promotor ante cambios del pH. En el estudio de la expresión del operón atpBEFHAGDC u operón f0f1 (F0F1-ATP sintasa), se observa un transcrito de 7'5 kb y un transcrito monocistrónico de 1'2 kb, estando ambos inducidos a pH 9.0. Se ha caracterizado la región promotora del operón f0f1 identificando un sitio de inicio de la transcripción (TSP), cuyas secuencias consenso para las cajas -10 y -35 parecen indicar una regulación por el factor sH. Mediante Northern con la cepa C. glutamicum ?sigH (cepa delecionada en el gen sigH, que codifica el factor sH), se concluyó que cuando este gen se deleciona se obtienen de nuevo los transcritos de 7'5 y 1'2 kb pero la inducción a pH 9.0 del operón observada anteriormente en ambos transcritos, desaparece en el mutante. El gen sigH de C. glutamicum forma un operón junto con el gen cg0877, expresándose en un transcrito bicistrónico de 0'9 kb inducido a pH 9.0, y en menor medida a pH 6.0. A través de ensayos de EMSA, se ha determinado que la proteína SigmaH se une al promotor del operón f0f1, relacionando directamente a este factor sigma con una regulación por pH básico en dicho operón. Mediante RT-PCR se ha demostrado la existencia del gen atpI situado corriente arriba del operón f0f1, cómo se transcribe independientemente del operón y que su expresión está también inducida a pH 9.0. La caracterización de la región promotora de este gen ha permitido identificar un TSP, que al contrario del promotor del operón f0f1, parece estar controlado por un factor sigma vegetativo. La deleción del gen atpI en C. glutamicum confirma el carácter no esencial del mismo. No se ha podido establecer una función concreta para la proteína AtpI, si bien el análisis del conjunto de los resultados obtenidos para la misma (cinéticas de crecimiento, ensayos de actividad ATPasa, efecto del Mg2+ en su crecimiento, y proteoma citoplasmático y de membrana), parece indicar un carácter modulador enfocado hacia el metabolismo central (glicólisis y ciclo de los ácidos tricarboxílicos), el metabolismo de compuestos sulfurados y también el metabolismo del nitrógeno.