CIENCIAS DE LA VIDA, 6

Autor: ALONSO CANTABRANA HUGO.
Año: 2005.
Universidad: MIGUEL HERNÁNDEZ DE ELCHE.
Centro de lectura: UNIVERSIDAD MIGUEL HERNANDEZ CAMPUS DE SAN JUAN.
Centro de realización: UNIVERSIDAD MIGUEL HERNANDEZ.

Resumen: Con el fin de identificar nuevas funciones génicas implicadas en el desarrollo del gineceo en Arabidopsis thaliana, se llevaron a cabo dos trabajos independientes. Por un lado, se realizó una mutagénesis química sobre la estirpe cer6, que permitió identificar el mutante zeppelin (zpl). Los frutos de estas plantas son más cortos y gruesos que los de la estirpe silvestre, debido aparentemente a una alteración en la dirección del crecimiento celular. Se caracterizó el fenotipo de estas plantas, y simultáneamente se inició el estudio de las interacciones genéticas con otros alelos mutantes, como fruitfull (ful) y crabs claw (crc). También se inició un estudio transcriptómico de este mutante. La mutación zpl afecta a la región 3' no traducida del gen At5g16220, de función desconocida. Por otra parte, se estudió el papel del gen ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) en el desarrollo del gineceo. Este gen está implicado en la represión de genes KNOX de clase I en los órganos laterales, pero hasta el momento no se había descrito su función durante la formación del fruto. Se caracterizó el fenotipo del fruto en el mutante simple as1, así como en varias combinaciones mutantes y en una línea de sobreexpresión de KNAT1. También se estudió la expresión de AS1, KNAT1, REPLUMLESS (RPL) y FUL en los gineceos silvestres y as1. Nuestros resultados indican que KNAT1 y AS1 participan en la regionalización del ovario. KNAT1 confiere identidad de replum y activa la expresión de RPL, mientras que AS1 y otros productos que se expresan en la valva se oponen a su función.

Autor: CASTAÑO CARDOSO JULIO.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA.

Autor: DIESTRA VILLANUEVA ELIA.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS 103.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA.

Autor: Farré Martí Ricard.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: Facultad de Veterinaria.
Centro de realización: Facultad de Veterinaria.

Resumen: ESTUDI DE LA NEUROTRANSMISSIÓ INHIBITORIA EN L'ESFÍNTER ESOFÀGIC INFERIOR. L'esfínter esofàgic inferior (LES) es l'encarregat de formar la barrera que separa l'esòfag de l'estómac, evitant així que el contingut gàstric estigui en contacte amb la mucosa esofàgica. S'ha descrit una asimetria muscular en LES, consistent en fibres circulars formant una U i adjacent a la curvatura menor (fibres de clasp -a la dreta-), i en fibres obliqües al costat de la curvatura major (fibres sling -a l'esquerra-). Aquests grups de músculs mantenen l'esfínter tancat i contribueixen al la pressió del LES. Estudis in vivo usant manometria esofàgica mostren una asimetria radial en la distribució de les zones d'alta pressió. Les zones d'alta pressió es registren en la direcció lateral esquerra de la regió del LES. El LES, com la resta dels esfínters, es caracteritza per tenir to. Aquest es d'origen miogènic i esta modulat per factors hormonals i mecanismes neurogènics que impliquen a les motoneurones del plexe mientèric (EMNs) i als nervis extrínsecs. Les motoneurones inhibitòries no adrenèrgiques no cholinèrgiques (NANC) son les encarregades de la relaxació de LES induïda per deglució i de les relaxacions transitòries de LES que causen el reflux gastroesofàgic patològic. In vivo, l'acetilcolina alliberada per les fibres vagals estimula les neurones inhibitories NANC mitjançant receptors nicotínics colinèrgics (nAchRs). L'òxid nítric (NO), VIP, ATP, PACAP i CGRP han estat proposats com a neurotransmissors d'aquestes motoneurones inhibitories en LES usant estudis morfològics i fisiològics. Moltes evidencies indiquen que l' NO es el principal neurotransmissor que participa en la relaxació de LES, la contribució relativa de la resta de candidats està en controvèrsia. S'han descrit diversos mecanismes d'interacció entre aquests neurotransmissors: a) alliberament en paral·lel i accions independents (co-transmissió) b) l'alliberament d'NO indueix a nivell del terminal alliberament de VIP i c) altres neurotransmissors indueixen pre- o post- sinàpticament la sintesis d'NO. La importància fisiològica d'aquestes interaccions no es gaire coneguda en LES. La majoria d'estudis sobre els mecanismes de relaxació del LES es centren en l'estimulació de les EMN per camp elèctric, no hi ha gaires dades de l'alliberament de NTs per altres estímuls fisiològics. Fa una centúria que Santiago Ramon i Cajal va proposar a les cèl·lules intersticials com a intermediaries en la neurotransmissió autonòmica (anomenades avui cèl·lules intersticials de Cajal). Recentment s'ha descrit un important paper de les cèl·lules intersticials de Cajal intramusculars (IC-IM) en la neurotransmissió inhibitoria depenent d'NO en LES de ratolí. Per aquest estudi 'in vitro' s'estudiaran, per la tècnica de bany d'òrgans, tires transmurals transversals de porc i de rata orientades en direcció de les fibres circulars. OBJECTIUS Els objectius del treball son els següents: 1- Avaluar l'efecte, l'alliberament per estimulació de les EMNs inhibitories per camp elèctric i activació de nAchRs, i la naturalesa de les interaccions entre els NTs inhibitoris en LES de porc (fibres de clasp). 2- Comparar la modulació del to i les respostes en estimular les EMNs amb EFS i per activació de nAchR entre els dos tipus de fibres que formen el LES del porc (clasp i sling). 3- Caracteritzar els neurotransmissors alliberats per estimulació de les EMNs inhibitories en el LES de rates control (W/+). Avaluar el paper de les ICC en la relaxació del LES induïda per camp elèctric en rates mutants (W/W) que no tenen IC-IM. CONCLUSIONSEl to en repòs del LES de porc es miogenic en el seu origen i està tònicament modulat per imputs colinèrgics exitatoris i nitrèrgics inhibitoris per part de les EMNs. La relaxació del LES de porc per estimulació neural amb camp elèctric o nicotina es produïda per l'alliberament d'NO i un neurotransmissor sensible a apamina. Aquest segon NTs es probablement ATP, però no podem descartar el PACAP, aplicats exògenament els dos NTs relaxen les tires de LES i aquesta relaxació es veu completament bloquejada per apamina en el cas del ATP i parcialment bloquejada en el cas del PACAP. L'efecte similar produït per L-NAME (inhibidor de la sintesis d'NO) i ODQ (inhibidor de la guanilat ciclasa) en la relaxació 8 induïda 9dd per camp elèctric i nicotina suggereixen en el nostre estudi un alliberament en paral·lel dels neurotransmissors, un efecte independent i no interacció en el seu alliberament. No podem atribuir un paper al VIP en l'estimulació neural, tot i que exògenament relaxa les tires de LES, aquesta relaxació no implica la generació d'NO. El CGRP no relaxa les tires de LES de porc com ocorre amb altres espècies animals. Les tires de clasp i sling desenvolupen un to semblant, encara que en les fibres de clasp el to depèn més del Ca++ extracelular. La modulació neural colinègic es molt més important en les tires d'sling que en les de clasp i la modulació nitrèrgica es semblant en les dos fibres. La relaxació induïda per l'estimulació neuronal amb camp electric es semblant en els dos tipus de fibres, en canvi la contracció es molt superior en les fibres de clasp. La relaxació de les fibres d'sling induïda per estimulació neural amb EFS es també produïda per alliberament d'NO i un neurotransmissor sensible apamin, més un tercer NTs. En canvi la induïda per nicotina es deu només a l'alliberament d'NO. Existeix una marcada asimetria funcional entre els dos tipus de fibres que formen el LES del porc. Les tires de LES procedents de rates mutants W/W (carència de IC-IM) desenvolupen un patró espontani de contraccions fàsiques que no tenen les seves rates germanes no mutants W/+. Les IC-IM juguen un important paper en el manteniment del patró basal en el LES de rata. La relaxació del LES de rata W/+ induïda per estimulació neural amb camp elèctric es produïda per l'alliberament d'NO i un neurotransmissor sensible a apamina, probablement ATP. La relaxació induïda per l'estimulació neuronal amb camp elèctric no està alterada en les rates mutants. Les IC-IM no tenen un paper limitant en la relaxació de LES de rata.

Autor: TAZÓN VEGA BÁRBARA YMAINE.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: FUNDACIÓ PUIGVERT.
Centro de realización: UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA.

Resumen: Esta tesis es una contribución al conocimiento de las bases moleculares del síndrome de Alport (SA), nefropatía hereditaria responsable del 1-2% de los casos de insuficiencia renal crónica terminal (IRCT) en los países occidentales. La promesa inherente a la genética molecular es que la revelación de estas mutaciones podría permitir establecer correlaciones genotipo-fenotipo y explicar la variabilidad clínica de la enfermedad, además de proporcionar una base más sólida para el consejo genético y el pronóstico de estos pacientes. Al tratarse el SA de una enfermedad genéticamente heterogénea y con distintos patrones de herencia, se han abordado sus diversas formas por separado y con objetivos específicos y novedosos que se exponen a continuación: · Investigar la posible relación molecular entre el síndrome de Alport autosómico recesivo (SAAR) y la Hematuria familiar benigna (HFB). · Realizar un cribado mutacional en los genes COL4A3 y COL4A4 en pacientes con síndrome de Alport ligado al cromosoma X (SALX); * Análisis de ligamiento de la región Xq22-q23. * Cribado mutacional del gen COL4A5. . Estudiar la viabilidad del diagnóstico genético preimplantacional específico para el síndrome de Alport ligado al cromosoma X (SALX). . Caracterizar una familia con síndrome de Alport ligado al cromosoma X (SALX) que presentaba una transmisión varión-varón dela enfermedad. El primer capítulo de resultados de este trabajo ahonda en la controversia que existía, antes de comenzar este trabajo, sobre la posible relación molecular entre el SA y la HFB, enfermedad renal que presenta unos rasgos clínicamente idénticos a los del estadio inicial del SA o los de los portadores del SAAR. Estas dos enfermedades renal que presenta unos rasgos clínicamente idénticos a los del estadio inicio genético al inicio de esta tesis, por lo que se creyó interesante identificar los defectos moleculares en pacientes que las padecen e intentar entender el paralelismo existente entre estas dos entidades clínicas. Se realizaron dos estudios mutacionales de los genes COL4A3 y COL4A4. Primero, en 54 pacientes pertenecientes a 11 familias no relacionadas con HFB (Badenas y cols., J Am Soc Nephrol 2002) y posteriormente, en 71 pacientes de 14 familias con SAAR y 2 con HFB (Tazón-Vega B,y cols., Am J Kidney Dis 2003). El segundo capítulo está dedicado a la forma del SA ligada al cromosoma X:SALX. Este teipo de SA es el más frecuente y, por tanto, el mejor caracterizado. Sin embargo, su diagnóstico molecular no estaba bien establecido cuando se inició este estudio. En este capítulo se presenta dos trabajos en vías de publicación y un tercero ya publicado. El primero, se centra en la mejora del diagnóstico molecular del SALX, mediante el refinamiento del análisis deligamiento de la región cromosómica Zq22-q23 y la puesta a punto de una metodología para la búsqueda de mutaciones en el gen COL4A5 causante de la enfermedad. Ésta, permite avanzar en el diagnóstico molecular del SALX, previamente basado sólo en el análisis de ligamiento, exteniéndolo a aquellos casos en los que esta técnica no es aplicable: casos esporádicos de la enfermedad y aquellos casos familiares donde se dispone de un número reducido de individuos. Esta técnica representa el primer método simultáneamente sencillo, rápido y eficiente, para el estudio molecular directo de este síndrome a partir de RNA. Este hecho permite determinar el efecto que casuan las mutaciones en el procesamiento del mRNA COL4A5. La técnica utilizada se basa en el análisis de toda la región codificadora del gen COL4A5, lo que permite a su vez determinar el efecto que casua la mutación en el procesamiento del mRNA de este gen. El segundo trabajo de este capítulo consiste en el desarrollo del diagnóstico genético preimplantacional específico del SALX e indpendiente del sexo del embrión. Por último, durante la realización de este trabajo se caracterizó el primer caso de concurrencia del SA y el síndrome de Klinefelter en una familia que presentaba una transmisión varón-varó 8 n del SA 1275 ligado al cromosoma X (Ars y cols., Eur J Hum Genet 2005). Las conclusiones de este trabajo son: 1.- La HFB está casuada por mutaciones en los genes CIL4A3 y COL4A4, que son también responsables del SAAR. Se han identificado 8 mutaciones no conocidas previamente en estos genes del colágeno tipo IV en familias con HFB, siendo las del gen COL4A3 las primeras mutaciones descritas en esta enfermedad. 2.- Se ha llevado a cabo el tercer cribado completo, descrito hasta el momento, de los genes COL4A3 y COL4A3 en familias con SAAR, que ha permitido identificar 9 nuevas mutaciones responsables de la patogénesis de esta enfermedad. Este estudio confirma que las mutaciones de tipo missense que afectan a residuos glicina son las más frecuentes en estos genes. 3.- Se ha demostrado, en 5 de la familias estudiadas, que la HFB y el estado deportador del SAAR podrían ser considerados una única enfermedad ya que estos pacientes comparten un mismo defecto molecular en los genes COL4A3 y COL4A4 y su evolución clínica es equivalente. 4.- La HFB, el estado de portador del SAAR y el SAAD, consideradas hasta ahora entidades clínicas diferenciadas, están todas causadas por una única mutación de los genes COL4A3 ó CIL4A4. Por tanto, podrían englobarse en el término "Nefropatía del colágeno tipo IV (cadenas a3/a4)" que da lugar a un espectro fenotípico que abarca desde microhematuria aislada hasta IRCT. 5.- La técnica SSCP/HA aplicada al análisis delos genes cIL4A3 y COL4A4 ha demostrado una sensibilidad del 62%, por lo que puede considerarse adecuada para el estudio de estos genes. 6.- Se ha mejorado el diagnóstico indirecto del SALX con la utilización de marcadores microsatélites que definen una región de 1.13-1.23 Mb alrededor del gen COL4A5. De esta forma se ha disminuido la posibilidad de recombinación entre los marcadores extremos y el gen de un 6% a un 1.2%, lo que reduce enormemente la posibilidad de errores en el diagnóstico. 7.- Se ha desarrollado un método sencillo y rápido de búsqueda de mutaciones en el gen COL4A5, causante del SALX, basado en el cribado de su región codificadora. Esta técnica posee una alta eficiencia de detección de mutaciones (76%). En consecuencia, se trata de una metodología que permite el diagnóstico directo de este síndrome por lo que es aplicable al estudio de casos esporádicos o núcleos familiares pequeños. 8.- El 41% de los pacientes con SALX a los que se le ha identificado la mutación presentan alteraciones en el splicing normal del mRNA COL4A5. Del total de las 22 mutaciones identificadas en el gen COL4A5, 5 de ellas (23%) no se hubieran calsificado como mutaciones desplicing de haberse realizado un cribado del gen basado en gDNA. 9.- El diagnóstico genético preimplantado específico del SALX es viable mediante el análisis de ligamiento en una única célula de los marcadores DXS1120, COL4A5-2B6 y DXS456 flanqueantes del gen COL4A5. 10.- Se ha descrito el primer caso de concurrencia del SA y el síndrome de Klinefelter, demostrando que en una familia con SA una transmisión varón-varón de la enfermedad no es siempre debida a un patrón de herencia autosóico sino que también puede ser causada por mutaciones en el gen CIL4A5. 11.- Se ha descartado el patrón de inactivación del cromosoma X, al detectarse que es al azar, como la causa del fenotipo severo de SA del varón que presenta la concurrencia de esta enfermedad y el síndrome de Klinefelter. Se ha detectado una expresión preferencial del transcrito con un splicing aberrante en este paciente (50%) comparada con la de su abuela portadora (8%). Este hallazgo podría explicar por qué las manifestaciones de SA en el paciente con un cariotipo 47. XXY son más parecidas a las de un varón con SALX que a las de una mujer portadora. Por último, en el anexo de la tesis se presentan tres trabajos adicionales también publicados durante la realización de este trabajo: Tazón y cols., Nefrología 2003; Praga y cols., Nefrología 2003; y torra ycols. Nephrol Dial Translant 2004.

Autor: Navarro Langa Juan Antonio.
Año: 2005.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: Facultat de Química.
Centro de realización: Departamento de Genética.

Resumen: La ataxia de Friedreich es una enfermedad humana neurodegenerativa y de herencia autosómica recesiva. Es la ataxia hereditaria más comun en la población caucásica. La enfermedad es causada por la deficiencia de la proteína frataxina. Las claves sobre la función de la frataxina provienen de los diferentes estudios llevados a cabo en varios organismos modelo. Se han aislado los genes ortólogos en un número elevado de organismos desde bacterias al ratón y también en plantas. En nuestro laboratorio se ha aislado el gen de Drosophila que codifica para la proteína frataxina, el gen fh. Drosophila ha resultado ser un excelente modelo para el estudio de enfermedades humanas dado que son muchos los procesos biológicos conservados entre la mosca y el hombre, como por ejemplo, la formación y degeneración del sistema nervioso, la generación y función del corazón, el metabolismo mitocondrial, etcâ¦En este trabajo se ha abordado el estudio de la función del gen fh en D. melanogaster empleando tres de las múltiples estrategias existentes en este organismo orientadas a la obtención de fenotipos mutantes: la movilización de elementos transponibles P, el sistema ARNi y la sobreexpresión. Con los experimentos de mutagénesis insercional no se obtuvieron los resultados esperados debido a que el gen fh es un gen pequeño localizado en una región rica en genes y flanqueado por dos e incluso tres puntos calientes de inserción. Se abordó entonces una segunda aproximación consistente en el uso del sistema UAS-GAL4 para el desarrollo de experimentos de sobreexpresión e interferencia. La interferencia o la sobreexpresión del gen fh en los tejidos afectados en los pacientes y en el desarrollo embrionario de Drosophila, inducen la aparición de letalidad, de alguna alteración fenotípica o de alguna modificación del comportamiento. Los defectos encontrados se concentran por una parte en el SNP, tanto en las neuronas y axones del componente sensorial, como en los axones del componente motor (en este caso las neuronas motoras no parecen afectadas). Por otra parte, se han observado alteraciones importantes en varios de los derivados del mesodermo embrionario, como son el músculo somático y las células cardiacas y pericardiacas. Todos estos defectos conducen a la aparición de 100% de letalidad antes de la emersión del adulto o a una disminución de la capacidad de supervivencia y escalada en los casos en los que se obtiene descendencia. La interferencia y la sobreexpresión en el músculo sólo han resultado efectivas si la alteración se produce en los primeros momentos del desarrollo de las estructuras afectadas. Por su parte, en el SNP sólo se han producido alteraciones cuando se han afectado conjuntos de precursores sensoriales o de neuronas sensoriales recién diferenciadas, que participan en la formación de los órganos sensoriales en el embrión y en el adulto. Pero al parecer, la función de fh no es igual de importante en todos los órganos sensoriales, ya que la modificación de su expresión en los órganos cordotonales no produce ninguna alteración significativa. Todos los resultados descritos permiten establecer un modelo, en D. melanogaster, para el estudio de la ataxia de Friedreich.

Autor: ARAN CORBELLA BEGOÑA.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: INSTITUT UNIVERSITARI DEXEUS.
Centro de realización: SERVICIO MEDICINA DE LA REPRODUCCION. INSTITUT UNIVERSITARI DEXEUS.

Resumen: La incorporación de la microinyección intracitoplasmàtica en los laboratorios de fecundación in vitro (FIV) ha permitido tratar a muchas parejas estériles que hasta el momento tenían que recurrir al semen de banco como única opción. A pesar de que los primeros estudios de seguimiento no detectaron más anomalías cromosómicas ni malformaciones en los niños nacidos mediante esta técnica, estudios más amplios han detectado una incidencia mayor. El objetivo de esta tesis es evaluar el riesgo genético en pacientes con oligoastenozoospermia (OA) sometidos a un programa de FIV-ICSI. Para ello se han realizado tres trabajos con los siguientes propósitos: " Analizar la frecuencia de anomalías cromosómicas, mediante hibridación in situ de fluorescencia (FISH), en los espermatozoides de pacientes estériles. " Estudiar la relación de las anomalías meióticas de pacientes que presentan oligoastenozoospérmia severa con los resultados clínicos de los ciclos de FIV-ICSI. " Valorar que puede aportar el screening de aneuploidías mediante el diagnóstico genético preimplantacional (DGP) en estos pacientes. En el primer estudio se analizaron espermatozoides de 19 pacientes estériles comparándolos con un grupo control de varones sanos. Se encontraron diferencias en la incidencia de diploidías y disomías para los cromosomas sexuales. En el segundo trabajo se analizaron 224 ciclos de FIV-ICSI realizados por 137 pacientes con OA severa, agrupados en tres grupos según el patrón meiótico (meiosis normal, bloqueo meiótico i anomalías sinápticas). No se encontraron diferencias significativas en las tasas de fecundación, embarazo, implantación y aborto entres los tres grupos. En el tercer estudio se han analizado 26 ciclos de DGP por alteraciones meióticas. Se ha observado un elevado porcentaje de embriones anormales. Las tasas de embarazo e implantación fueron superiores a las de un grupo de pacientes con las mismas características que no realizaron DGP, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. Es importante realizar un estudio exhaustivo a los pacientes estériles antes de realizar un ciclo de FIV-ICSI. Es recomendable realizar estudios de meiosis en biopsia testicular y de FISH en espermatozoides para poder dar un consejo genético individualizado para cada pareja y en casos de alto riesgo plantear realizar un DGP para aumentar las posibilidades de transferir un embrión cromosómicamente normal.

Autor: SANTIAGO GONZALVO NÉSTOR.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: INST.DE BIOL. MOL. DE BARCELONA (CSIC).
Centro de realización: INST. DE BIOL. MOL. DE BARCELONA (CSIC).

Resumen: El trabajo presentado en esta tesis se centra en el estudio del impacto de los elementos transponibles sobre los genes y genomas vegetales y en los mecanismos de control de la transposición en estos genomas. Para ello se ha analizado, por un lado, la dinámica que ha seguido la familia Emigrant de MITEs dentro del genoma de Arabidopsis. Y, por otro lado, se analiza el control de la transcripción del retrotransposón Tnt1 de tabaco. 1. ESTUDIO DEL IMPACTO DE LOS ELEMENTOS TRANSPONIBLES SOBRE LOS GENOMAS VEGETALES: Análisis de la familia Emigrant de MITEs de Arabidopsis thaliana. Los MITEs son pequeños transposones de DNA sin capacidad codificante, presentes en un elevado número de copias en la mayoría de los genomas. Se postula que son movilizados por elementos autónomos emparentados, presentes en los mismos genomas. El primer grupo de MITEs descrito en Arabidopsis fue la familia Emigrant (Casacuberta et al., 1998). El objeto de nuestro estudio es conocer la dinámica de estos elementos y su efecto sobre la evolución de los genes y genoma de Arabidopsis. se ha diseñado un programa informático para identificar todas las copias de elementos Emigrant contenidas en el genoma de Arabidopsis. Con tal de encontrar el máximo número de elementos Emigrant, se fundamentó la búsqueda en las repeticiones terminales (TIRs) conservadas que definen esta familia de MITEs. De esta forma se pueden encontrar subfamilias representadas por un bajo número de copias o aquellas copias antiguas y, por tanto, más divergentes. También se han desarrollado otras herramientas informáticas que han permitido realizar análisis filogenéticos y evolutivos de estos elementos. A su vez, mediante técnicas moleculares se ha estudiado el polimorfismo de estos MITEs existente entre diferentes ecotipos de Arabidopsis. Mediante estos análisis se han identificado 151 copias Emigrant distribuidas por todo el genoma de Arabidopsis. La mayoría de éstas se pueden agrupar en tres familias, cada una de las cuales puede ser subdividida, a su vez, en subfamilias de variabilidad diferente. El análisis de estas subfamilias ha revelado que mientras que las copias más recientes se localizan lejos de secuencias génicas, aquellas más antiguas aparecen frecuentemente asociadas a genes. Esto sugiere que los elementos Emigrant han podido jugar un papel importante en la evolución de los genes de Arabidopsis. Además la existencia de polimorfismos de inserción de estos transposones entre diferentes ecotipos de Arabidopsis indica la existencia de una actividad reciente de movilización de estos elementos. 2. ESTUDIO DEL CONTROL DE LA TRANSPOSICIÓN: Análisis del control de la expresión del retrotransposón Tnt1 de tabaco. Tnt1 fue el primer retrotransposón activo de plantas descrito (Grandbastien et al., 1989). Está presente en cientos de copias en el genoma de tabaco y se expresa en ciertas condiciones de estrés (Casacuberta y Grandbastien, 1993; Mhiri et al., 1997). Por otra parte, el silenciamiento génico parece ser el principal mecanismo por el que los diferentes organismos controlan la proliferación de los elementos transponibles y secuencias extrañas dentro de sus genomas (Hammond et al., 2001; Rudenko et al., 2003). En el trabajo presentado en esta memoria se analiza el control de la expresión del retrotransposón Tnt1 a nivel de la terminación de la transcripción y poliadenilación del mRNA y a nivel de la conformación de la cromatina, mediante el estudio de cambios en el silenciamiento de Tnt1 en condiciones de estrés. Se analiza la existencia y variación de intermediarios del silenciamiento, como siRNAs y modificaciones de la cromatina. En este trabajo se han diseñado diferentes estrategias para inducir el silenciamiento transcripcional de transgenes cuya expresión está promovida por el promotor 35S del CaMV. Los resultados obtenidos indican que en condiciones de estrés se relaja el silenciamiento del retrotransposón Tnt1 sin que se vea comprometido el silenciamiento de otros transgenes estudiados. Por esta razón se decidió caracterizar molecularmente el silenciamiento de Tnt1. Se han identificado siRNAs que pueden estar mediando la represión de Tnt1 en hoja de tabaco, cu 8 ando est 4d7 e elemento no se transcribe y sus secuencias promotoras están asociadas a cromatina inactiva. Por otra parte, con tal de conocer de qué manera Tnt1 supera su silenciamiento y se expresa en situaciones de estrés, se ha analizado la influencia de la región U3 de las LTRs de este retrotransposón (donde se localizan los elementos promotores de su transcripción) sobre este proceso. Los resultados obtenidos sugieren que la región U3 no es suficiente para superar el silenciamiento de Tnt1 y que quizás otras secuencias de la LTR o factores estructurales son las que permiten la expresión del retrotransposón.

Autor: ALCARAZ SEGURA DOMINGO.
Año: 2005.
Universidad: ALMERÍA.
Centro de lectura: DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA VEGETAL Y ECOLOGÍA, UNIVERSIDAD DE ALMERÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE ALMERÍA.

Resumen: El cambio global afectará de forma importante a la biodiversidad y a los servicios ecosistémicos. El empleo de atributos funcionales de los ecosistemas a escala regional en la evaluación de las consecuencias de estos cambios se muestra ventajoso a la hora de conectar los estudios locales y globales y de cara a establecer programas de seguimiento. Sin embargo, no son muchos los trabajos a escala regional que analizan los efectos del cambio global sobre el funcionamiento de los ecosistemas de la Península Ibérica o que proporcionen una situación de referencia frente a la que comparar el efecto del uso de la tierra y de los cambios climáticos y atmosféricos sobre los ecosistemas. En esta Tesis se documentaron los patrones espaciotemporales de la fracción de radiación fotosintéticamente activa (fPAR) interceptada por parte de la vegetación actual de la Península Ibérica, así como las tendencias observadas en la misma para los ecosistemas protegidos bajo la Red Española de Parques Nacionales. También, se exploraron los controles climáticos y de usos del suelo que subyacen detrás de los patrones encontrados. Para ello, se empleó como medida integradora del funcionamiento ecosistémico un estimador del fPAR y, por tanto, de la productividad primaria neta: el índice Verde Normalizado (NDVI) obtenido a partir de imágenes NOAA/A VHRR entre 1982 y 1999. Se utilizaron los siguientes atributos funcionales de las curvas estacionales de este índice: la integral anual, la variabilidad intraanual o rango relativo, los valores máximo y mínimo de NDVI, la época en la que se alcanzan estos valores, y las variabilidades interanuales de todos ellos. Se identificaron Tipos Funcionales de Ecosistemas que recogieron de forma sintética la heterogeneidad espacial del fPAR en la Península y cuyos patrones sugieren que el uso de la tierra modifica a escala regional los ciclos del carbono. La precipitación, la temperatura, la vegetación potencial y el tipo de uso por el cual se la reemplaza, controlaron la magnitud y el sentido de las diferencias en la dinámica del NDVI. La caracterización de atributos funcionales en áreas naturales, seminaturales y protegidas de España reveló los diferentes controles que determinan la dinámica del NDVI a lo largo de los gradientes ambientales entre la Región Mediterránea y la Eurosiberiana. El análisis sobre parques nacionales mostró algunos huecos en la Red y permitió diferenciar aquellos parques que representan tipos de funcionamiento ecosistémico singulares en el contexto ibérico, de aquellos tros que constituyen paisajes representativos del funcionamiento de gran parte de la vegetación ibérica. Además, nuestros resultados pusieron de manifiesto cómo los parques nacionales españoles, áreas con altos niveles de protección, tendieron a aumentar la productividad y a disminuir las diferencias entre las estaciones de crecimiento y de reposo en el corto plazo. En conjunto, esta Tesis ofrece una caracterización de referencia frente a la que evaluar los efectos del cambio global sobre el funcionamiento de los ecosistemas ibéricos y con la que incorporar aspectos funcionales de los ecosistemas a las políticas de conservación de la naturaleza y de mantenimiento de los servicios ecosistémicos, en concreto, los relacionados con el secuestro de carbono.

Autor: PORRAS MILLAN PABLO.
Año: 2005.
Universidad: CÓRDOBA.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Las glutarredoxinas (Grxs) son pequeñas proteínas (10-12 kDa) que catalizan reacciones oxidorredución de grupos tiol de proteínas y otras biomoléculas, desempeñando diversas funciones (mantenimiento de la homeostaiss rédox celular, catálisis de reacciones de glutationilación-desglutationilación de proteínas). Estos procesos revisten una especial importancia en el comportamiento mitocondrial de la célula eucariota, donde se produce la mayoría de las especies reactivas de oxígeno (EROs). En la presente tesis se ha estudiado la glutarredoxina 2 (Grx2p) de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se ha encontrado una nueva actividad para la Grx, en la que ésta puede catalizar la reducción del glutatión por lipoamida reducida, compuesto que tan sólo se encuentra en el interior de la mitocondria. La Grx2p de S. Cerevisiae resulta ser especialmente eficiente en este proceso, en comparación con otras glutarredoxinas, lo que apunta a un posible significado fisiológico aún por determinar. También se ha encontrado varias isoformas de la Grx2p, que se encuentran repartidas entre el citosol, el retículo endoplásmico y la membrana externa y la matriz mitocondriales, todas procedentes del gen grx2, que da lugar a dos productos fde traducción diferenciados por la presencia o no de una presecuencia señal para mitocondría y retículo endoplásmatico. Mediante técnicas de mutagénesis dirigida y estudios de importancia in vivo e in vitro de la Grx2p y sus formas mutantes, se ha determinado que un fenómeno de doble naturaleza (barrido imperfecto-traslocación ineficiente), no descrito hasta ahora, es el responsable de la peculiar distribución subcelular de los productos del gen grx2 en S. Cerevisiae. Se abre de este modo un interesante campo para futuras investigaciones en las que se determine qué función o funciones fisiológicas justifican la selección evolutiva de este complejo mecanismo que extiende el alcance de acción de la Grx2p a varias localizaciones subcelulares.

Autor: PIÑEIRO CID ROBERTO.
Año: 2005.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPMOSTELA.
Centro de realización: HOSPITAL CLÍNICO UNIVERSITARIO DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.

Resumen: La hormona de crecimiento (GH) y adiponectina son dos hormonas estrechamente relacionadas con las funciones cardiovasculares. Esta relación viene demostrada por el hecho de que alteraciones en la secreción de ambas, se asocian con el desarrollo de complicaciones cardiovasculares. Por este motivo, esta tesis se ha centrado en estudiar los efectos de ambas hormonas sobre aspectos de la biología de los cardiomiocitos como son la viabilidad y el metabolismo. La GH ejerce efectos beneficiosos sobre el corazón, y además es un regulador de la muerte por apoptosis en diversos modelos celulares. Por estos motivos, el trabajo trató de estudiar un posible papel regulador de la GH sobre la apoptosis en cardiomiocitos. Se utilizaron dos modelos celulares de cardiomiocitos, el cultivo primario de cardiomiocitos neonatales de rata (CP), y la línea de ratón HL-1. Los resultados obtenidos mostraron la expresión del ARNm del receptor de GH en cardiomiocitos, y que la hormona fue capaz de activarlo mediante fosforilación así como a las proteínas JAK2 y STAT5. El tratamiento con GH ejerció un efecto protector sobre los cardiomiocitos frente a la apoptosis inducida por deprivación de suero (CP), o por el tratamiento con el citostático AraC (HL-1). Este efecto anti-apoptótico de la hormona fue directo y no mediado por la acción de IGF-1, ya que no se modificaron los niveles de ARNm y proteina de IGF-1 tras el tratamiento con GH, ni la presencia de un anticuerpo anti-IGF-1 revirtió la acción protectora de GH. El análisis de este efecto demostró que la proteina fosfatasa calcineurina actúa como mediador de las acciones anti-apoptóticas de la GH en cardiomiocitos, ya que la combinación de dos inhibidores especificos de ésta revirtieron el efecto de la GH. Se comprobó también que el tratamiento con AraC inducia la activación de p38 MAPK, hechos que se vio parcialmente prevenido por la hormona de crecimiento. Estos resultados permiten concluir que la GH ejerce un efecto protector frente a la apoptosis de los cardiomiocitos de forma directa y no mediada por IGF-1, además de que dicho efecto está mediado por la acción de la calcineurina. La adiponectina es una adipocitoquina producida abundantemente por los adipocitos, y se cree que juega un papel decisivo en la relación existente entre obesidad, resistencia a insulina y riesgo cardiovascular. Este trabajo investigó la síntesis y secreción de adiponectina por cardiomiocitos, asi como posibles efectos funcionales sobre el metabolismo de los mismos. Se utilizaron como modelos celulares los dos anteriormente mencionados, y el cultivo primario de cardiomiocitos adultos humanos. El análisis de expresión génica, mostró la expresión del ARNm de adiponectina por parte de cardiomiocitos. De igual manera se determinó la expresión de los ARNm de los dos receptores de adiponectina, AdipoR1 y AdipoR2. La utilización de anticuerpos específicos permitió comprobar la síntesis proteica de adiponectina y ambos receptores, y también determinar la secreción de adiponectina al medio de cultivo por parte de los cardiomiocitos. El tratamiento de cardiomiocitos de rata y HL-1 con adiponectina estimuló la captación basal de glucosa y la ya inducida por insulina. La hormona fue capaz también de activar mediante fosforilación a la kinasa dependiente de AMP o AMPK, la cual podría estar mediando el efecto de adiponectina sobre la captación de glucosa, según se determinó utilizando un inhibidor específico de ésta (araA). El tratamiento con adiponectina también estimuló la captación de ácidos grasos libres en cardiomiocitos HL-1, pero no tuvo ningún efecto sobre la apoptosis inducida por serodeprivación, ni sobre la proliferación basal de cardiomiocitos de rata y HL-1 respectivamente. Por otro lado, se demostró que adiponectina fue capaz de estimular la acumulación de nitritos en el medio de cultivo por parte de cardiomiocitos de rata, ef 8 ecto que 505 se demostró mediado por la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) o NOStipo 11.La presencia del inhibidor de iNOS aminoguanidina, inhibió la acción de adiponectina sobre la acumulación de nitritos. La acción estimuladora de adiponectina sobre iNOS se determinó también a nivel de proteína, observándose una inducción de la expresión de la sintasa. Estos resultados ponen de manifiesto que los cardiomiocitos expresan, sintetizan y secretan adiponectina, y que esta hormona presenta efectos funcionales sobre el metabolismo de los cardiomiocitos.

Autor: LEIS MARTINEZ HUGO.
Año: 2005.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA LUGO.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: NF-kappaB, P13K1Akt Y GR son moléculas esenciales que participan, de una manera conjunta y coordinada, en el control de diversos aspectos de la homeostasis de los queratinocitos, incluyendo la resistencia a la apoptosis, la proliferación y la diferenciación epidérmica, asi como el proceso inflamatorio cutáneo. El complejo IKK es un punto central en la regulación de la actividad NF-kB y numerosas señales convergen en él. La subunidad reguladora IKKgamma es esencial para la función del complejo IKK y su falta de función total o parcial se correlaciona con diversas patologias humanas que se caracterizan por defectos primarios en uno o más epitelios. En este trabajo hemos abordado el estudio funcional de IKKg en queratinocitos en cultivo y en piel de ratón in vivo, mediante el uso del mutante de delección IKKg-DN97, que actúa como un dominante negativo de función NF-kB. IKKg-DN97 provoca el desacoplamiento de los complejos, dando como resultado una inhibición parcial y dependiente de dosis de la actividad NF-kB inducible. Además produce alteraciones morfológicas y un aumento de la apoptosis de los queratinocitos sin estimular, bloqueando la degradación de IkappaBalpha y la localización nuclear de p65, aumentando los niveles de PTEN y reduciendo la fosforilación de Akt. Hemos generado ratones transgénicos que expresan IKKg-DN97 en los queratinocitos basa les de la epidermis y otros epitelios estratificados (K5-IKKg-DN97), los cuales presentan alteraciones en la morfogénesis folicular y la respuesta inflamatoria cutánea. Mediante aproximaciones de tumorigénesis in vivo, hemos demostrado que Akt contribuye a la progresión tumoral de los queratinocitos a través de la inhibición parcial de GSK3beta, permitiendo la localización nuclear de CycD1 mediante diversos mecanismos que aumentan la expresión y estabilidad de la ciclina. Asimismo, hemos demostrado que parte de los efectos antitumorales de los GCs durante la carcinogénesis epidérmica están mediados por la interacción de GR con PI3K/Akl. Dicha interacción da lugar a una disminución de la actividad PI3K/Akt, de la actividad IKK y de la actividad de unión de NF-kB al ADN debido, al menos en parte, a un descenso en los niveles de IKKg.

Autor: ABELENDA VILA JOSÉ ANTONIO.
Año: 2005.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOXÍA.
Centro de realización: FACULTADE DE BIOLOXÍA.

Autor: OTERO ADRÁN MIGUEL.
Año: 2005.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA. UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de realización: HOSPITAL CLÍNICO UNIVERSITARIO DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.

Resumen: La leptina, una hormona de 16KDa descubierta en el año 1994, es capaz de unir la homeostasis energética y el sistema inmune mediante la integración de distintos factores orexigénicos y anorexigénicos así como a través de sus acciones directas sobre el timo y la secreción de citoquinas. La leptina está sintetizada fundamentalmente por el tejido adiposo, perteneciendo por tanto al amplio grupo de las adipocitoquinas. Estructuralmente, la leptina pertenece a las citoquinas de la familia de la interleuquina(IL)-6. Los niveles de leptina circulante mantienen una relación directa con los de la masa grasa corporal. La primera función descrita de laleptina fue su acción como adipostatina: actuando a nivel central, la leptina incrementa el gasto energético y minimiza la ingesta manteniendo asi un equilibrio energético óptimo y una cantidad de grasa corporal adecuada. Además de esa función central, la leptina ejerce un gran número de funciones periféricas, todas ellas mediadas por un receptor específico (Ob-R), codificado en el gen db, con seis isoformas distintas de las que sólo la isoforma larga, Ob-Rb, es completamente funcional. Dentro de las funciones periféricas de la leptina destaca su papel regulador del sistema inmune: las alteraciones en los niveles circulantes de leptina implican cambios en la respuesta inmune debidos a alteraciones en la función de las células T ya modificaciones en la secreción de citoquinas, entre otros. Además, se ha demostrado que los niveles de leptina están elevados en la artritis reumatoide, una patología autoinmune de afectación sistémica que implica alteraciones en la homeostasis del cartílago articular. Recientemente se ha descubierto que los condrocitos, las células que forman el cartilago y mantienen su homeostasis, sintetizan y secretan leptina. Esta secreción está incrementada durante la artrosis, una patologia de degradación primaria del cartílago, y tras la administración de leptina exógena, lo cual sugeria un papel dírecto y pro-inflamatorio de la leptina en el cartílago articular. Teniendo en cuenta la importancía del óxido nitrico (NO) en la mediación de la respuesta de las citoquinas en los condrocitos; considerando el papel de la Nitróxido Sintasa (NOS) tipo 11en la producción de NO en los procesos inmunes e inflamatorios, y atendiendo a la capacidad de la leptina de inducir la formación del NO en macrófagos, cabía la posibilidad de una acción pro-inflamatoria directa de esta adipocitoquina en el cartílago articular a través de la NOS tipo 11. Los objetivos de este trabajo han sido: , 1. Estudiar el efecto de la leptina, en combinación con el interferon-gamma y la interleuquina-1, sobre la inducción de la Nitróxido Sintasa tipo 11en cultivos de condrocitos in vitro. 2. Estudiar los mecanismos moleculares implicados en la ruta de transducción que lleva a la activación de la Nitróxído Sintasa tipo I1inducida sinérgicamente por la leptina y el interferon-gamma o la interleuquina-1 en condrocitos en cultivo. Para la realización de este estudio se ha empleado la línea condrogénica murina ATDC5, que nos ha permitido trabajar con condrocitos en distintos estados de maduración. También se han empleado cultivos primarios de condrocitos humanos. La actividad de la NOS tipo 11se ha determinado a través de la acumulación de nitrito en el sobrenadante de cultivo. Para el estudio de las moléculas implicadas en la via de señalización se han empleado distintos inhibidores para JAK-2 (Tyrphostin AG490 y Tkip), PI-3K (Wortmannina y LY294002), MEK-1 (PD098059) y p38K (SB203580). Se realizaron, además, estudios de expresión del ARNm y la proteina NOS tipo 11mediante RT-PCR en tiempo real y Western Blot respectivamente. Nuestros resultados demostraron que la leptina por si misma no es capaz de inducír a la NOS tipo 11en condrocitos pero, en acción sinérgica con la IL-1 o el interferon-gamma, actúa como una citoquina pro-in 8 flamator 4b6 ia, implicando la inducción de la enzima a través de una ruta de señalización que implica a las quinasas JAK-2, PI-3K, MEK-1 Y p38 MAPK. En conclusión: 1. La leptina induce, de forma sinérgica con el interferon-gamma y la interleuquina-1, la expresión de la NOS tipo 11en condrocitos. 2. La inducción sinérgica de la Nitróxido Sintasa tipo 11en condrocitos estimulada por la leptina, en combinación con la interleuquina-1 yel interferon-gamma, implica una vía de señalización común, en al que participan las quinasas PI-3K, MEK-1 Y p38 MAPK.

Autor: SOTO SÁNCHEZ CRISTINA.
Año: 2005.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: VIGO.

Resumen: El subnúcleo reticular dorsal (SRD) se encuentra localizado en la formación reticular medial caudal al óbex. Estudios realizados en roedores indican que recibe información nociceptiva e incrementa su transmisión tanto hacia niveles supraespinales como hacia la médula espinal. En roedores, la transmisión ascendente viaja por el lemnisco medial hacia el núcleo ventral-medial talámico, y la transmisión descendente por el fascículo dorsolateral. Dado que los datos procedentes de este núcleo se han obtenido en estudios histológicos y comportamentales realizados en roedores, decidimos determinar la localización de las neuronas del SRD en el gato y estudiar sus propiedades electrofisiológicas. Los resultados obtenidos indican que: * En el gato, el SRD se localiza en la formación reticular situada en la médula oblonga caudal al óbez, pero a diferencia de lo que sucede en roedores, existe una cierta distribución somatotópica de las neuronas en el núcleo, de modo que las que reciben información a través de las columnas dorsales se encuentran en la región más medial de la formación reticular. * Al igual que en roedores y en primates, las neuronas del SRD son activadas únicamente por estímulos nociceptivos. * El 62% (n=102/165) de las células registradas envían un axón a la médula spinal. * El 44% (n=24/55) de las neuronas examinadas fueron activadas antidrómicamente por la estimulación de la formación reticular bulbar medial. * El 9% (9/103) de las neuronas examinadas fueron antidrómicas a la estimulación del lemnisco medial, a diferencia de lo que sucede en roedores donde la proyección rostral de estas neuronas se realiza a través del lemnisco medial. * El 82% (n=27/33) de las células activadas antidrómicamente por la estimulación rostral también fueron antidrómicas a la estimulación medular, de modo que la información que se envía como retroalimentación a la médula es la misma que se envía rostralmente. Los resultados demuestran que en el gato, al igual que en la rata, las células del SRD procesan información dolorsa. Sin embargo, en el gato, estas células proyectan a niveles supraespinales más rostrales fundametnalmente a través de la formación reticular medial y en menor proporción a través del lemnisco medial. Aunque no sabemos el lugar de terminación de estas proyecciones a través de la formación reticular, datos histológicos indican que terminan a niveles reticulares más rostrales desde donde además pueden transmitirse hacia los núcleos intralaminares talámicos para alcanzar la corteza cerebral. Dado que la formación reticular bulbar alberga circuitos promotores relacionados con acciones motoras involuntarias que proyectan directamente a las motoneuronas del astra ventral de la médula espinal, el SRD puede participar en las reacciones motoras asociadas a proceso nociceptivos y dirigidas a prevenir o reducir el dolor generado por estímulos nociceptivos externos e internos. Esto puede ser importante para las reacciones posturales de defensa que se adoptan en respuesta a la presencia de un foco doloroso y que implican la modificación del tono de los grupos musculares dirigidos a inmovilizar la región dolorosa y alejarla de estímulos que puedan incrementar esa situación. Además, si la información que se transmite rostralmente alcanza la corteza cerebral a través de los núcleos intralaminares, la corteza podría controlar las reacciones posturales actuando a nivel de las células del SRD que proyectan a la formación reticular y a la médula espinal.

Autor: Mariñas Pardo Luis Antonio.
Año: 2005.
Universidad: A CORUÑA.
Centro de lectura: Facultad de Ciencias.
Centro de realización: Facultad de Ciencias.

Resumen: El sistema reproductivo de machos y hembras de las especies que forman los géneros Mytilus y Ensis no presenta ningún signo de diferenciación sexual a nivel estructural. En este trabajo se aborda el estudio del dimorfismo sexual de estos géneros, utilizando para ello diferentes marcadores moleculares. Los mejillones engloban a las especies dioicas de esta clase con las que más estudios de todo tipo se han realizado hasta el momento actual. Por otra parte, las navajas son organismos cuyo interés científico se encuentra en auge debido a su creciente potencial económico. Los mecanismos que propician la diferenciación sexual en ambos casos todavía están comenzando a esclarecerse, por ellos Mytilus y Ensis son utilizadas en este trabajo como punto de partida a la hora de abordar el poco documentado dimorfismo sexual de los bivalvos a nivel molecular. El análisis del comportamiento de las cinco mitocondrias paternas contenidas en el espermatozoide de M. galloprovincialis muestra que estas penetran en el interior del óvulo durante la fecundación. Tras la misma, permanecen viables en el interior del 56,4% de los zigotos analizados, agregadas y sin dividirse hasta al menos la tercera división mitótica, donde pueden ser vistas en el micrómero 1d. Este último, dará lugar a la formación de la gónada en individuos adultos, con lo que las mitocondrias paternas quedan confinadas a las células gonadales de individuos macho. Los polimorfismos RAPD generados, mostraron una elevada sensibilidad en la identificación de diferencias moleculares entre sexos en M. galloprovincialis, donde el loci denominado MG-ABA5-750 presentó porcentajes de efectividad cercanos al 80%. En E. arcuatus cuatro de los loci estudiados (EA-ABA2-500, EA-ABA3-700, EA-ABA7-750 y EA-ABA11-750) poseían porcentajes de efectividad cercanos al 70% de presencia en machos y ausencia en las hembras. Los marcadores ISSR generados confirmaron el potencial de la técnica para constituir una alternativa al aislamiento y caracterización de microsatélites y generar marcadores especie-específicos. El microsatélite denominado MG-ISSR20-250, aislado de una de las secuencias, permite diferenciar individuos de la especie M. galloprovincialis de los M. edulis. Otro de ellos identifica individuos de la especie E. arcuatus y no amplifica nunca en ejemplares de E. siliqua. Ambos marcadores podrían conformar un buen método para la diferenciación molecular de dichas especies. La abundancia de repeticiones en tándem de la secuencia (GT) n es superior a la de (CT)n en todas las especies estudiadas. En M. galloprovincialis y E. arcuatus existe un dimorfismo sexual de base molecular, en virtud del cual los machos presentan mayor abundancia de repeticiones (GT)n que las hembras. La realización de una genoteca de sustracción entre sexos de M. galloprovincialis permitió caracterizar cinco fragmentos de ARN mensajero presentes en gónadas de machos adultos y ausentes en las de hermbras, mostrando la existencia de genes con expresión diferencial entre sexos. La amplificación con cebadores diseñados para amplificar secuencias de ADN pertenecientes a enzimas con actividad carboxileesterasa permitió obtener un marcador que diferencia machos y hembras de M. galloprovincialis independientemente del estadío reproductor en el que se encuentren, ya que amplifica en el 100% de los machos estudiados y nunca lo hace en las hembras. También permitió caracterizar secuencias similares específicas de macho en E. arcuatus y E. siliqua, corroborándose su presencia en otras especies como Donax trunculus y Venerupis rhomboides.

Autor: ARIAS ESTEBAN ARMANDO.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID.
Centro de lectura: SALA RAMON ARECES.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Las poblaciones de virus RNA son complejas distribuciones de genomas altamente relacionados entre sí pero no idénticos que se denominan cuasiespecies. La distribución de una cuasiespecie viral depende de la aparición continua de nuevos mutantes y de procesos de competición y selección que actúan sobre ellos. La alta heterogeneidad genética observada en la cuasiespecie es debida a la baja fidelidad de copia por parte de las RNA-polimerasas virales y a la ausencia de actividades correctoras de errores durante el proceso replicativo. Estas distribuciones de mutantes confieren a la cuasiespecie una gran capacidad adaptativa frente a presiones selectivas. Es por ello que las poblaciones de virus RNA se comportan como un sistema adaptativo, ya que son capaces de responder a cambios que se producen en el ambiente. Se ha descrito que algunos sistemas adaptativos, como es el sistema inmune, guardan una "memoria" de eventos pasados a los que han estado expuestos. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es profundizar en los mecanismos moleculares que intervienen en la replicación de los virus RNA y las implicaciones evolutivas que tiene este proceso en la dinámica de las cuasiespecies virales. Hemos caracterizado la presencia de genomas "memoria" en la línea C9.22 del virus de la fiebre aftosa (VFA). Estos genomas presentan como marcador genético una inserción de oligo-A interna que precede al segundo codón AUG de inicio de la traducción de la poliproteína viral. Cuando C9.22 fue sometido a pases a alta multiplicidad de infección, genomas revertientes que no presentaban esta inserción desplazaron rapidamente a los genomas con inserción. Esta inserción dejo de ser detactable en la secuencia consenso de la población del pase 20 (C9.22p20). Sin embargo, la inserción quedaba retenida en genomas memoria de esta línea evolutiva, como mostró el análisis de las poblaciones de los pases 50 y 150 (C9.22p50 y C9.22p150). Los genomas memoria aumentaron su eficacia biológica durante los pases, a pesar de ser desplazados por los revertientes, de acuerdo con la hipótesis de la Reina Roja. Hemos analizado, el espectro de mutantes de la cuasiespecie C9.22p50 por clonaje biológico y clonaje molecular de tres regiones genómicas diferentes. Los resultados obtenidos han proporcionado una información detallada de tipos y frecuencias de mutación, así como la presencia de "hotspots" o "puntos calientes" para las alteraciones genómicas en esta población viral. Este análisis ha mostrado una caracterización indistinguible del espectro de mutantes de una cuasispecie mediante clonaje biológico y clonaje molecular. Hemos expresado y purificado la polimerasa de VFA (3D) y hemos estudiado los requerimientos básicos para su actividad enzimática en ensayos "in vitro". La caracterización de este enzima es crítica para el estudio y entendimiento de la naturaleza errónea de la replicación de VFA. La polimerasa 3D purificada ha permitido al grupo de la Dra. Nuria Verdaguer obtener por difracción de rayos X las estructuras tridimensionales de 3D sola y de 3D en complejo con una molécula que actúa como molde-cebador (a 1,9-A y 3,0-A de resolución, respectivamente). Estas estructuras han permitido identificar los residuos críticos implicados en la interacción con la molécula de RNA que actúa como molde-cebador. Se han identificado en poblaciones de virus RNA sometidas a mutagenesis letal numerosas mutaciones en polimerasas 3D de genomas presentes en esa población. Alguno de ellos, en particular mutantes del residuo Gly 118, provocan la falta de actividad enzimática detectable, sugiriendo un papel crítico de este residuo en la actividad RNA-polimerasa.

Autor: AGIRREZABALA COLMENERO XABIER.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Resumen: Los bacteriófagos de DNA de doble hebra son sistemas modelo adecuados para el estudio de procesos biológicos básicos como las interacciones moleculares que se producen durante el ensamblaje y maduración viral, o el comportamiento de motores moleculares que actuan durante el empaquetamiento del DNA viral. Mediante el empleo de la criomicroscopía electrónica y procesamiento de partículas individuales, se han determinado ensamblados del bacteriófago T7 producidos durante su ruta morfogenéteca. La estructura de la precabeza revela la presencia de la proteína de andamiaje, el núcleo y el conector, involucrados estos últimos en el empaquetamiento del DNA, y que están situados en uno de los vértices pentaméricos. La reconstrución del virión maduro revela cambios drásticos en la cápsida, la desaparación de la proteína de andamiaje, y cambios estructurales drásticos en el núcleo, que en este caso sobresale de la cápsida para interaccionar con la cola. Alguno de estos cambios estarian originados por la presión ejercida por el DNA empaquetado. Además, la estructura del conector a 8 A de resolución obtenida a partir de partículas recombinantes, ha mostrado la presencia de un motivo alfa-beta conservado en su dominio distal, zona de la estructura implicada en el proceso de empaquetamiento de DNA.

Autor: RIQUELME GABRIEL CRISTINA.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: A lo largo de esta memoria se describe la generación de vectores virales basados en el genoma del coronavirus TGEV con el fin de responder preguntas básicas sobre la replicación del virus así como sobre su uso como sistema de expresión de genes heterólogos. Se han construido genomas TGEV con todos los genes separados por sitios de restricción por endonucleasa. La separación de los genes TGEV implicó la duplicación de secuencias del extremo 5' de cada gen, siendo éste un dominio de secuencia asociado con la regulación de la transcripción, que afecta al crecimiento del virus in vivo y a su virulencia. En esta tesis, se aporta la primera demostración de que el gen 7 de TGEV es un gen no esencial para la viabilidad del TGEV. Además, se demuestra que la deleción del gen 7 afecta a la replicación de TGEV, y atenúa su virulencia en lechones, su hospedador natural. Asímismo, se ha mostrado que la introducción de una o más modificaciones en el genoma de TGEV llevó a la generación de una colección de recombiantes de TGEV con un grado variable de virulencia. Por otro lado, se ha determinado que el gen E es esencial desarrollando un genoma de TGEV deficiente en el gen E y en los genes no esenciales 3a y 3b. Para la generación de viriones defectivos en el gen E, éste se ha complementado en trans mediante células empaquetadoras que expresan la proteína E. En ausencia de la proteína E se bloqueó la formación de viriones maduros durante la morfogénesis del virus obteniéndose viriones inmaduros no infectivos que se acumulan en el ERGIC. Asímismo, se han generado vectores con tropismo dirigido a la especie canina mediante la sustitución del dominio globular de la proteína S del TGEV por la del coronavirus canino superando la primera barrera de restricción de la infección, la entrada del virus. Se han desarrollado vectores con tropismo canino competentes en replicación y propagación. Estos conocimientos posibilitan la generación de vectores con tropismo y virulencia predeterminada, unas caracterísitcas que son esenciales para el desarrollo de sistemas de expresión que permitan utilizar estos vectores para la obtención de vacunas recombinantes seguras y en terapia génica. Se han diseñado sistemas de expresión específicos para las especies porcina y canina con las que se han expresado antígenos heterólogos de interés para inmunizar a estas especies con el fin de determinar el grado de protección frente a infecciones frecuentes de las mismas.

Autor: MOLNAR MURO CRISTINA.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: La formación de las venas del ala de Drosophila melanogaster requiere la actividad de las rutas de señalización Notch, EGFR y Dpp. Para identificar nuevos miembros de estas rutas hemos realizado una mutagénesis de ganancia de función y hemos seleccionado unas 13.000 nuevas inserciones P-UAS. En combinación con una línea Gal4 específica de venas hemos seleccionado y mapeado 500 inserciones P-UAS, identificando aproximadamente 300 genes que cuando se sobre-expresan en las venas pupales afectan a la formación de venas, a diferenciación celular o a la morfología del ala. Hemos identificado en esta mutagénesis el 70% de los miembros conocidos de las rutas Notch, EGFR y Dpp. En este trabajo presento los resultados de la mutagénesis y el análisis de tres de las líneas seleccionadas, que afectan a los genes Moesina, LanB1 y CG9056. Moesina pertenece a la familia ERM, un grupo de proteínas citoplasmáticas que unen el citoesqueleto de actina sub-cortical a proteínas transmembrana específicas. Hemos generado un nuevo alelo de falta de función moe (moeC858) y hemos estudiado sus fenotipos en el ala adulta, encontrando dos principales defectos: 1) tamaño reducido de ala, defectos en la axila y presencia de vesículas diferenciadas como tejido de ala entre las dos superdicies dorsal y ventral del ala, y 2) alteraciones en el patrón de la vena L3. El análisis de los correspondientes discos imaginales revelan profundas alteraciones en la morfología del disco imaginal de ala, así como cambios en la expresión de varios genes diana de la ruta de señalización Hedgehog. La actividad de otras rutas de señalización como Notch, Dpp, Wg y EGFR no se modifica en discos de ala moeC858. Sugerimos que Moe tiene un nuevo requerimiento en la señalización hh que es independiente de su función durante la morfogénesis epitelial. El segundo gen analizado codifica una de las tres subunidades de Laminina: LanB1. Laminina es un componente de la membrana basal. La sobre-expresión de lanB1 causa defectos en el patrón de venas similar a aquellos observados cuando la actividaad de la ruta de Notch está reducida. Hemos caracterizado los fenotipos de ganancia de función de LanB1 y hemos inducido dos alelos de falta de funciín de este gen. La falta de LanB1 afecta a la adhesión entre las superficies del ala dorsal y ventral. Finalmente, hemos analizado el gen CG9056, cuya sobre-expresión causa falta de diferenciación de venas. Hemos analizado la falta de función de CG9056, encontrando que este gen se requiere para prevenir formción de venas antagonizando las rutas de señalización EGFR y/o Dpp.