BIOLOGIA MOLECULAR

Autor: BEYER KATRIN.
Año: 2002.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE A CORUÑA.

Resumen: La enfermedad de Alzehimer (EA) es genéticamente heterogénea. Los casos se pueden clasificar por antecedentes familiares en EA familiar y EA esporádica, y por la edad de comienzo de la enfermedad en EA precoz con un debut antes de los 65 años y EA tardía con un debut a partir de los 65 años de edad. En aproximadamente el 1% de todos los casos se detectan antecedentes familiares, y el 1% de éstos presentan un patrón de herencia autonómico dominante. La causa del 80% ésta última forma de la EA son mutaciones puntuales en los genes de la proteína precursora del beta-amiloide (APP) y las presenilinas (PS1 y PS2). En la EA esporádica el alelo e4 del gen APOE actúa como un importante factor de riesgo que explica aproximadamente el 50% de los casos de EA esporádica y tardía. El alelo E4 confiere riesgo, pero su presencia no es imprescindible ni suficiente para causar la enfermedad. Otros factores genéticos interactúan con la apolipoproteína E y el resultado de esta interacción es la aparición de la enfermedad. Se están investigando genes que de alguna manera pudieran estar relacinados con la aparición de los cambios neuropatológicos en la EA. En algunos de estos genes se han descrito polimorfismos que confieren riesgo a padecer la EA. En este trabajo se han analizado varios factores genéticos para determinar su papel en el desarrollo de diferentes tipos de EA y se ha determinado una estrategia para la detección de locio de efecto menor para el desarrollo de la EA. En el estudio de los genes causantes de la EA se identificó la asociación de una nueva mutación (V148I) del gen de la PS2 en un paciente con antecedentes familiares de debut tardío, mientras mutaciones APP y PS1 no fueron detectadas. El análisis del gen de APOE corroboró que el alelo APOE*4 es un factor de riesgo mayor en todos los pacientes con EA hasta los 80 años y constituye el factor de riesgo más importante para enfermos que debutaron entre los 60 ty 64 años. Además, el efecto del alelo APOE*4 es dosis-dependiente precipitando el genotipo APOE4/4 elcomienzo de la EA. La detección de la presencia de loci menores es posible únicamente dividiendo la población estudiada en subgrupos separados por intervalos de cinco años de edad. Los genes de la cistatina C, PS 1, butirilcolinesterasa (BChE) y catepsina D (catD) son loci de efecto menor. Específicamente, el alelo CST3-A es fun factor de riesgo para personas menores de 65 años,e l genotipo PS1 1/1 actúa en sinergia con el alelo APOE*4 en los pacientes que debutaron antes de los 69 años y los alelos BChE-K y catD-T son marcadores que confieren riesgo en los enfermos que debutaron entre los 75 y 79 años. El polimorfismo Th1/E47 del promotor de APOE también puede considerarse como un locus de efecto menor. El alelo Th1/E47-G presenta un factor de riesgo para los pacientes con EA que debutaron después de los 80 años. Además de factores que refieren riesgo a padecer la EA fueron detectados dos alelos protectores en el promotor de APOE. El alelo -491AT-T se encuentra acumulado en individuos control menores de 65 años en comparación con los enfermos y con los controles de los otros grupos de edad, convirtiéndose de ese modo en factor protector. El alelo Th1/E47-T se encuentra acumulado en individuos control de 75 años y mayores en comparación con los enfermos y con los controles de los otros grupos de edad. Por tanto, puede considerarse que el alelo Th1/E47-T es un factor de protección en individuos de 75 años y mayores.

Autor: YUSTE PARRA MARÍA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Las cepas de E.coli que originan la lesión de adhesión y borrado provocan diarrea tanto en humanos como en animales. La lesión típica de estas bacterias en la mucosa intestinal consiste en la íntima unión que se establece entre las bacterias y los enterocitos y en la destrucción de sus microvellosidades. La capacidad de originar esta lesión reside en el locus del borrado del enterocito, que codifica un sistema de secreción tipo III, las proteínas secretadas por este sistema denominadas EspA, EspB y EspD, la intimina, que media una adhesión íntima de las bacterias al enterocito y está codificada por el gen eae, y el Tir, receptor de laintimina que es translocado al interior de la célula hospedadora. El grado de conservación en el extremo N-terminal de la intimina es muy elevado, mientras que el extremo C-terminal, constituido por 280 aminoácidos, es muy variable. Mediante variación antigénica, pruebas de PCR y secuenciación, al menos 18 tipos del gen eae han sido identificados. Con oligonucleótidos basados en las secuencias genéticas de los genes eae, espA, espB, espÇD y tir pudimos diferenciar siete tipos del gen eae: Beta1, beta2, gamma1, gamma2/0, *,*,*, cuatro tipos del gen espA: alfa, beta1, beta2 y gamma, tres tipos del gen espB: alfa, beta y gamma, tres tipos del gen espD: alfa, beta1 y gamma1, y cuatro tipos del ger tir:: alfa, beta1, gamma1 y gamma2. Todos los tipos del gen eae, excepto uno (*), mostraron siempre la misma asociación de los genes espA, espB, espD y tir. Seis cepas fueron negativas a todos los tipos de gen eae probados y se enviaron al LREC para su secuenciación. El resultado fue que tres de ellas presentaron el tipo * del gen eae y las otras tres mostraron un nuevo tipo de intimina, el p. A pesar de que el tipo beta 1 del gen eae fue el más frecuente entre los ECAE aislados tanto de rumiantes sanos como diarreicos, los porcentajes de las cepas de ECAE con este tipo encontrados en este estudio en animales diarreicos (56-100%) fueron más altos que los encontrados en animales sanos (33,3-42,2%). Estos datos sugieren que las cepas de ECAE con el gen eaebeta1 podrían estar asociadas con la presentación de diarrea en rumiantes. Las cepas de ECEP se han clasificado como típicas y atípicas. Las ECEP típicas son causa de diarrea infantil en países en vías de desarrollo, se han aislado casi exclusivamente en humanos, presentan el gen bfpA y, salvo excepciones, sólo presenta los factores de virulencia codificados por el LEE. Pro el contrario, las ECEP atípicas están asociadas a diarrea en los países desarrollados, no presentan el gen bfpA pero frecuentemente poseen diversos factores de virulencia, como la toxina EAST1, no codificada por el LEE. Seis cepas de ECEP analizadas en este trabajo fueron astA-positivas y bfpA-negativas, por ello pueden clasificarse como ECEP atípicas. Todas estas cepas, excepto una, se aislaron de vacas sanas. Estos resultados sugieren que el ganado vacuno sano pude considerase como un importante reservorio de cepas d ECEP potencialmente patógenas para seres humanos. La inmunidad específica desarrollada frente a lintimina juega un importante papel en la protección contra la infecicón. Los anticuerpos anti-intimina presentes tanto en calostros como leche humana producen una reducicón en la adherencia de las cepas de ECAE a los cultivos celulares además de reflejar una infección previa en la madre y así poderse utilizar como herramienta epidemiológica. En rumiantes, la contrario que en humanos, no se ha investigado la influencia de la respuesta inmune frente a la intimina. Este es el primer trabajo en el que se investiga la presencia de anticuerpos frente al extremo C-terminal compuesto de 280 aminoácidos de la intimina beta en calostro y suero de cabritos

Autor: GODINO GÓMEZ JAVIER.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: HOSPITAL CLÍNICO SAN CARLOS LAB. ONCOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: Para la realización de esta tesis se seleccionaron 82 familias españolas sospechosas de padecer el síndrome de cáncer hereditario no polipósico (HNPCC) en total se estudiaron 239 pacientes. La base molecular de este síndrome son defectos en la reparación de errores que se producen durante la replicación del ADN. En un 90% de los casos es debido a mutaciones en los genes MLH1 o MSH2. Estudiamos en estas familias la inestabilidad de microsatélites MSI por PCR y secuenciación y la Inmunohistoquímica IH como pruebas de identificación de familias portadoras de mutación en MLH1 o MSH2. A la vista de nuestros resultados proponemos la MSI como prueba inicial de selección y la IH como prueba secundaria para determinar cual de los 2 genes es probable que esté mutado. Estudiamos la presencia de mutaciones germinales en estos 2 genes por PCR+DGGE, encontramos 12 mutaciones diferentes en 15 familias en MLH1 y 10 mutaciones diferentes en 10 familias en MSH2, la mayoría de estas mutaciones (88%) se encuentran en familias que cumplen los criterios de Amsterdam I o II, solo un 12% se encuentran en familias con menor agregación familiar. En el 54% de las familias que cumplían los criterios de Amsterdam I o II se encontró mutación frente a solo un 7% en familias que no los cumplen. Las mutaciones en MSH2 fueron mayoritariamentes delecciones con alteración del marco de lectura y producción de una proteina truncada. En MLH1 en cambio predomian los cambios de nucleótidos con generación de un colon de parada o bien de un cambio de aminoácido, la patogenicidad de estos cambios de aminoácido se estudia por LOH y segregación con la enfermedad. No se observan relaciones genotipo-fenotipo claras aunque la presencia de mutaciones en MSH2 se asoció a una menor edad media de diagnóstico de los tumores (48 años frente a 50.4 en portadores de mutación en MLH1) y más proporción de tumores extracolónicos (42% frente a 34%) en ningún caso estas diferencias alcanzaron significación estadística.

Autor: ARRIBAS GARCÍA MÓNICA.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El estudio de la Diabetes tipo II tiene una gran importancia, ya que aporta soluciones para un grave problema de la sociedad envejecida de los países desarrollados occidentales, en la cual esta enfermedad tiene una alta prevalencia. En el presente trabajo, hemos tratado de dilucidar las funciones de tres proteínas IRS en un tejido diana de la insulina concreto, el tejido adiposo marrón. En los adipocitos marrones se expresan mayoritariamente dos de esas proteínas, IRS-1 e IRS-2. A niveles significativamente menores, se expresan también IRS-3 e IRS-4. El trabajo de esta tesis doctoral aporta resultados que aseguran el papel principal a IRS-1 en la mediación de la función de la insulina como inductora de la diferenciación del adipocito marrón. Así, la carencia de IRS-1 en los adipocitos marrones conlleva unas deficiencias importantes en el fenotipo adipogénico y termogénico de estas células. Con respecto al primero, los adipocitos deficientes de IRS-1 presentan menor contenido de lípidos en su citoplasma, así como una menor expresión de la sintetasa de ácidos grasos y del factor de transcripción ADD-1/SREBP1c en respuesta a la insulina. Por lo que respecta al fenotipo termogénico de los adipocitos marrones carentes de IRS-1, se ha observado una falta total de respuesta a la insulina para inducir la síntesis, a nivel transcripcional, de la proteína descoplante tipo 1 (UCP-1), mientras que otras proteínas descoplantes no se ven alteradas. Además, la expresión y la actividad transcripcional del factor C/EBP alfa en respuesta a la hormona están disminuidas. La pérdida de IRS-1 en el adipocito marrón provoca ciertas alteraciones en la señalización intracelular de la insulina. En primer lugar, se pierde por completo la actividad PI3-K asociada a IRS-1 y aparece un defecto parcial en la activiación de dicha enzima asociada a fosfotirosinas. En segundo lugar, la falta de IRS-1 conlleva una incapacidad casi total de la célula para activar la proteína Akt. Se ha comprobado que la carencia de IRS-1 bloquea la activación de todas las isoformas de Akt en respuesta a la insulina. Estas alteraciones de la señalización de la insulina provocan las carencias mencionadas en el fenotipo de los adipocitos deficientes de IRS-1. El IRS-2 es el otro substrato del receptor de la insulina expresado mayoritariamente en los adipocitos marrones. Hemos comprobado, que dicho substrato no substituye completamente al IRS-1 en las funciones anteriormente descritas. Sin embargo, el IRS-2 ejerce otras funciones metabólicas. En ausencia completa de IRS-2, los adipocitos marrones pierden la capacidad de transportar la glucosa al interior celular en respuesta a la insulina, y el mecanismo de translocación del transportador de glucosa GLUT 4 a la membrana plasmática, por el cual el primer proceso es posible. En este trabajo, se han investigado los defectos que produce la falta de señalización de la insulina a través de IRS-2. Los adipocitos carentes de dicho substrato no presentan actividad PI3-K asociada a IRS-2 y muestran una actividad PI3-K global menor. Estas alteraciones se completan con la pérdida de actividad PKC* en respuesta a la insulina. Nuestros resultados relacionan la pérdida de la señalización de la insulina a través de IRS-2 y PKC-* con la disminución en la captación de glucosa por los adipocitos marrones. Por último, se ha estudiado la capacidad del IRS-3 como molécula alternativa al IRS-1 en la señalización de la insulina en el adipocito marrón. Los adipocitos carentes de IRS-1 que sobreexpesan IRS-3 recuperan cierta señalización intracelular en respuesta a la insulina como la activación de PI3-K y de Akt. Se ha comprobado, que la activación de esta ruta de señalización de la insulina por IRS-3 es determinante para la recuperación de la respuesta a la insulina, en cuanto a la expresión de marcadores adipogénicos como FAS y ADD-1/SREBP1c en respuesta a la insulina. Sin embargo, la presencia de IRS-3 no restablece la expre 8 sión de 2ff UCP-1 ni del factor C/EBP alfa en dichas células.

Autor: GUAL GARCÍA LORENA.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La deficiencia de Immunoglobulina A (D IgA) es la imnunodeficiencia primaria más comun en poblaciones caucásicas (1/600 individuos). Sus manifestaciones son muy variables y abarcan desde la sintomatología hasta infeciones recurrentes en los tractos respiratorios y gastrointestinal con diferntes grados de afectación. Su etiología es desconocida, pero se apunta a que puedan existir defectos en las etapas de diferenciación de las células B productoras de IgA de membrana de células B plasmáticas productoras de IgA secretada. A veces se ha observado cierta agregación familiar en esta enfermedad , por lo que pueden existir determinantes genéticos de susceptibilidad para la D IgA ,Estos genes etarían localizados dentro del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), porque es l azona del genoma en la que se ha visto una mayor asociación a la D IgA. Anteriormente se han visto asociados prositivamente a la enfermedad los haplotipor portadores de los siguientes alelos del gen DRB1 (localizado en el MHC de clase II)DR3,DR1(subtipo DRB10102)y DR7. Nuestro propósito es localizar finalmente los genes de susceptibilidad dentro de esto haplotipos, utilizando para ello herramientas como es estudio TDT y la commparación de los haplotipos hallados en la población española con los de otras poblaciones norteeuropeas . Otro objetivo fue averiguar si existían haplotipos de protección para la D IgA , dado que enotros estudios se había descrito que el alelo DR2 estaba asociado negativamente a la enfermedad. Por último , se quisieron estudiar las posibles intercciones géneticas entre los haplotipos de susceptibilidad y de protección a la D IgA. Nuestros resultados muestran la existencia de diferentes genes de susceptibilidad en los diferentes haplotipos MHC , unos localizados en la región de Clase II (alrededor del locus DR-DQ)y otros enla región de Clase III. También averiguamos que el subtipo DRB1 1501 del alelo DR2 es marcador de un gen protector para la enfermedad, y que este gen está presente en todos los haplotipos portadores de esta alelo . Por último , se constató que la presencia combinada de dos alelos de susceptibilidad cualesquiera otorgada mayor riesgo a padecer D IgA, mientras que la aparición conjunta de un alelo de susceptibilidad con el alelo protector eliminaba la susceptibilidad aportada por el primero.

Autor: FERNÁNDEZ FRANCO LAURA.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa se caracterizan por una inflamación intestinal crónica de origen desconocido que afecta a 6-8 individuos e cada 100.000 en España. La enfermedad celiaca es una condición en la cual el gluten proveniente de la dieta no se tolera, provocando una inflamación crónica del intestino delgado, y que afecta a 1 de cada 300 individuos en España. La epidemiología ha aportado una información considerable sobre los factores de susceptibilidad a estas tres enfermedades digestivas. La descripción de gradientes geográficos de prevalencia y los estudios de migraciones apoyan la existencia de factores ambientales. Sin embargo, la distribución irregular de la prevalencia según el fondo racial y, sobre todo, la mayor frecuencia de la enfermedad entre familiares de pacientes y particularmente entre gemelos monozigotos son sólidos argumentos a favor de una susceptibilidad genética, que según toda evidencia, implica la interacción de varios genes. A lo largo de los últimos decenios se han valorado en estudios de asociación y de ligamiento numerosos genes candidatos según la idea de una patogenia mediada por el sistema inmune, y recientemente se han efectuado estudios de ligamiento rastreando todo el genoma con marcadores anónimos. Los resultados disponibles, con discrepancias entre estudios debidas a doferencias metológicas y a una mala clasificación de los pacientes, subrayan el papel de la región del cmplejo mayor de histocompatibilidad (MHC), localizado en el brazo corto del cromosoma 6, como el principal determinante genético para estas enfermedades: Sin embargo, se postula que la aportación a la susceptibilidad de estas enfermedades que confieren otros genes no situado sen el MHC pudiera ser importante, e incluso mayor. OBJETIVOS 1,- Estudiar la posible existencia de asociación y ligamiento del gen MICA (localizado dentro del MHC) con la enfermedad celiaca. Este estudio se realizará mediante un análisis caso-control y posterior análisis en familias (TDT). 2,- Determinar posibles relaciones genotipo-fenotipo en la enfermedad de Crohn mediante el estudio de genes del MHC de clase II. 3,- Localizar en el MHC, mediante la técnica del mapeo de microsatélites, la localización de genes de susceptibilidad a la colitis ulcerosa. 4,- Valorar el papel de los polimorfismos de la citocina anti inflamatoria IL-10 en la susceptibilidad a padecer enfermedad inflamatoria intestinal. CONCLUSIONES 1,- El alelo MICA5.1 (Clase III del MHC) es un marcador, dentro del haplotipo ancestral 8.1 (H.A. 8.1), de un segundo gen de susceptibilidad en la enfermedad celiaca. 2,- La forma ileal de la enfermedad de Crohn se caracteriza genéticamente por encontrarse asociada positivamente con el alelo DRB1*07 y con las mutaciones en el gen NOD2/CARD15, pero negativamente con el alelo DRB1*0103. 3,- La forma colónica de la enfermedad de Crohn se caracteriza genéticamente por la ausencia de asociación con los alelos DRB1*07 y las mutaciones en el gen NOD2/CARD15; pero se encuentra fuertemente asocaida al alelo dRB1*0103, alelo de susceptibilidad que comparte con la colitis ulcerosa. 4,- En el MHC, la combinación de los siguientes alelos: DRB1*0103, d6s273-5, bat2-8, tnfA11B4C1D3E3, ikbl+378(C) y MICA5.1, aparece como el mayor determinante genético de suscpetibilidad y extensión en nuestra población de colitis ulcerosa. 5,- El alelo 14 del microsatélite IL-10G y el alelo -1082G del promotor del gen de la IL-10, especialmente cuando aparecen juntos en un individuo, son marcadores de susceptibilidad a la enfermedad de Crohn en nuestra población.

Autor: CROOKE ÁLVAREZ ALMUDENA.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Las dificultades par obtener una vacuna eficaz frente a Plasmodium falciparum y la capaciedad de parásito de desarrollar resistencia frente a los fármacos antimalários sugieren , como estrategia en la investigación, la exploración de nuevas dianas funcionales que permiten el desarrollo de nuevos abordajes terapérutocos frenta ala malaria.La validación de un gen , ó de su producto , como diana requere conocer la función del mismo dentro de la biología del parásito.En este sentido, se han venido desarrollando distintos sistemas para el análisis funcionales de genes de P.Falciparum como la inactivación de genes por recombinación , los sistemas de silenciamiento mediante RNA antisentido ó mediante RNA interferente.Los objetivo de este trabajo de investigación han sido:la selección de genes modelo en P.falciparum que pudiesen representar dianas específicas par el diseño de nuevos agentes antimaláricos , explorar distintos sistemaas de silenciamiento de genes en P.falciparum, para lo que ha sido necesario la construcción de una colección de vextores, el diseño de oligoribonucleótidos cortos y la optimizqación de sistemas de transfección , y pro último desarrollar sistemas molecualres de análisis del efecrto funcional del silenciamiento en el ciclo biológico del parásito. La introducción y expresión de material genético exógeno en Plasmodium falciparum es transitoriamente eficiente, pero la baja segragación de plásmidos supone un grave impedimento par la expresión a largo plazo y el establecimiento de clones del parásito.El silenciamiento mediante interrupción por recombinación homóloga para análisis de la función de genes cuanta con importantes inconvenientes experimentales.Es posible el silenciamiento parcial de genes mediante interferenca con RNA, bien como RNA antisentido o como RNA de doble cadena de paqueño tamaño, que parecen inhibir su traducción por un mecanismo compartido ,El silenciamiento de genes maedante RNA de doble cadena de pequeño tamaño es el sistema de elección. En el presente , en Pfalciparun para evaluar la función individual de genes de interés. Se ha desarrolladdo un método que permite cuantificar la expresión de RNAm utilizando cantidades mínimas de cultivo de P. Falciparum que ha supuesto un considerable aumento en la sensibilidad y permite su escalado para el análisis de expresión de un elevado número de genes en multiples condiciones experimentales de cultivo. Con los sistemas de silenciamiento en P. Falciparum hemos podido constatar que existen una alta correlación entre niveles de RNAm y de su producto en los dos genes estudiados Pfg6pd y Pfrab5a.El análisis del silenciamiento de la Rab5A demuestra la dispensabilidad de su función quizás como consecuencia de la existencia de isoformas en el genoma del parásito.El análisis del silenciamientos de la G6PG ha puesto de manifiesto la importancia de la propia G6PD y del sistema tioredoxina y en particulasr de la tioredoxin reductasa en la cascada antioxidante del parásito , y por lo tanto en su supervivencia.El difente tamaño de la proteína PfG6PD ,obsevado mediante inmunodetección,en función del estadoi del parásito indica la existencia de mecanismo de procesamiento particulares de esta proteína bifuncional de estructura única en el género Plasmodium.

Autor: ALVAREZ DE FRUTOS CRISTINA.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS QUÍMICAS.
Centro de realización: INSTITUTO CAJAL,CSIC.

Resumen: En trabajos anteriores del laboratorio se ha demostrado que la familia génica Snail está implicada en la inducción de la transición epitelio-mesénquima(TEM) tanto durante el desarrollo embrionario (Nieto y col.1994;Del Barrio y Nieto,2002)como en la progresión tumoral (Cano y col.,2000;Blanco y col., 2000).Esta función se realiza ,al menos en parte , por la represión directa de la transcripción del gen de la cadherina E, si bien se piensa que sebe tener dianas adicionales. Estudios funcionales en el embrión de ratón han mostrado que Snail es fundamental para la TEM,pues los ratones mutantes mueren enetapas temperaturas de formación de mesodermo debido a su incapacidad de llevar a cabo esta transición (caver y col.2001).Esta inviabilidad hace imposible el estudio de la función de Snail en procesos de desarrollo más tardío (formación de cresta neural o cartílagos entre otros)o en procesos patológicos en el adulto.Por ese motivo,la finalidad de este proyecto ha sido la puesta a punto de un sistema de expresión inducible de Snail en el raton. En este trabajo se describen un sistema de expresión condicionada del factor de transcripción Snail, consistente en una construcción plasmatica que contiene la región codificante de dicho factor de transcripción unida a un dominio de unión a estrógenos , previamente mutado, que presenta elevada afinidad por un estrógeno sintético, el 4-hidroxi-tamoxifeno.Tras su administración , el estrógeno es capaz de inducir la actividad de la proteína Snail por su traslocación tumoral. Hemos inducido la actividad de Snail en tres momentos del desarrollo de los ratones. En embriones en estadios de preimplantación , la activación de Snail va acompañada de la pérdida gradual de la cadherina E y la consecuente descompactación de los oocitos provenientes de los ratones trasgénicos.Este fenotipo debería ser suprimido por represores de Snail , por que proponemos el cultivo de embriones preimplantación como sistema de escrutinios para agentes represores potenciales. La introducción de la actividad de Snail en ratones post-natales ha ocasionado un incremento en la vasculación de los huesos largos, y la colonización de los mismos por un exceso de osteoclastos.El aumento de esta población celular debe ser la responsable de la descalificación ósea que presentan estos ratones,sugiriendo que la activación patológica de Snail en el adulto podría dar lugar a este fenotipo degenerativo.Asimismo, la inducción de Snail da lugar un fenotipo de enanismo , acompañado de una disminución de la placa de crecimiento , problablemente causada por inhibición de la proliferación celular,fenotipo que ha sido confirmado en embriones de ratón tardíos.

Autor: RODRIGUEZ DE LA CONCEPCIÓN M. LUISA.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD BIOLOGÍA.

Resumen: Los resultados presentados en esta Tesis se engloban en tres bloques de estudio: La Implicación del adipocito marrón en la lipomatosis Inducida por la terapia antiretroviral de elevada actividad (HAART), el estudio de nuevos factores reguladores de la función mitocondrial en el adipocito marrón y el efecto de los fármacos antiretrovirales en adipocitos en cultivo. El análisis de la expresión del gen marcador del adipocito marrón UCP-l en varios lipomas de pacientes infectados con VIH y en terapia antiretroviral implica al adipocito marrón en la etiopatología de la lipomatosis asociada a la terapia HAART. El estudio de la regulación de la biogénesis mitocondrial a nivel molecular en adipocitos marrones, nos llevó a observar que la diferenciación del adipocito marrón va asociada a la inducción de los factores de transcripción mitocondrial Bl y B2 Y el co-activador PGC-la, en asociación con una incrementada biogénesis mitocondrial. La expresión génica de estos factores es regulada de forma positiva por agonistas de PPARy e insulina. Por el contrario, la noradrenalina reprime la expresión de los factores de transcripción mitocondrlal Bl y B2 por mecanismos dependientes de transcripción e independientes de síntesis proteica. Ello da lugar a una reducción en la expresión de genes codificados por el genoma mitocondrial como la subunidad II de la citocromo c oxidasa. Este efecto es dependiente del grado de diferenciación del adipocito marrón y se ve favorecido por la presencia de activadores de PPARyo insulina. La expresión del co-activador PGC-la se induce por noradrenalina, agonistas PPARyy agonistas RXR en adipocitos marrones diferenciados, pero no en preadipocitos. Dichas inducciones se dan por mecanismos independientes de síntesis proteica. La inducción de PGC-la por la noradrenalina se ve favorecida por la presencia de activadores PPARy. La inducción por agonistas PPARy y RXR se bloquea por un antagonista PPARy y es independiente de la activación de receptores adrenérgicos. Se describe, por tanto, una nueva vía de regulación PPARyjRXR-dependiente del gen PGC-la. Se estudió el efecto del litio, un fármaco utilizado en el tratamiento de la esquizofrenia y el trastorno bipolar, sobre la diferenciación del adipocito marrón. Se observó que el litlo inhibe de forma dependiente del tiempo de exposición y de la dosis la diferenciación morfológica de adipocitos marrones en cultivo, así como la expresión de genes de expresión preferencial en al adipocito marrón. Estudiamos el efecto de los fármacos antiretrovirales inhibidores de la transcriptasa reversa sobre el adipocito marrón mediante el análisis de su diferenciación y expresión génica en relación con la función mitocondrial. Los resultados nos indicaron que los inhibidores de la transcriptasa reversa no-análogos de nucleósido tienen un efecto opuesto sobre la diferenciación del adipocito marrón: el efavirenz bloquea la acumulación de iípidos mientras que la nevirapina tiene un efecto positivo global sobre la diferenciación adipocitaria, biogénesis mitocondrial y expresión de UCP-1. Los inhibidores de la transcriptasa reversa análogos de nucleósidos no afectan la diferenciación del adipocito marrón. La estavudina, zidovudina y didanosina provocan una disminución en el contenido de mtDNA, aunque la expresión del genoma mitocondrial sólo se encuentra disminuida en las células tratadas con didanosina. La compensación a la depleción del mtDNA en las células con estavudina podría explicarse por el aumento en la expresión de los factores de transcripción mitocondrial. Además, la estavudina induce de manera específica la expresión génica de UCP-l mediante mecanismos que implican la vía del ácido retinoico. Por último, desarrollamos un modelo celular de adipocitos humanos en cultivo primario y lo utilizamos en el análisis del efecto del fármaco a 8 ntiretro 2cf viral didanosina. Los resultados nos mostraron que preadipocitos humanos en cultivo primario pueden diferenciarse a adipocitos con características morfológicas, de expresión génica y funcionales propias del adipocito blanco humano. La dldanosina ejerce efectos compatibles con un bloqueo en la función mitocondrial.

Autor: SORIANO ZARAGOZA FRANCESC XAVIER.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FAC.BIOLOGIA.
Centro de realización: FAC.BIOLOGIA U.BARCELONA.

Resumen: RESUMEN: Mitofusina 2 (Mfn2) es una proteína de fusión mitocondrial. Las evidencias experimentales demuestran una menor expresión génica de Mfn2 en músculo esquelético de sujetos obesos y pacientes diabéticos de tipo 2. Al inhibir la expresión de Mfn2 en células en cultivo se reduce el consumo de oxígeno, el potencial de membrana mitocondrial y la oxidación de glucosa, indicando un papel relevante de Mfn2 en la biología mitocondrial así como en la fisiopatología de la obesidad y/o la diabetes de tipo 2. Además, se han relacionado mutaciones en el gen de Mfn2 con la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth de tipo 2 y se le ha descrito un papel antiproliferativo en desordenes vasculares. Consecuentemente, el estudio de la regulación de la expresión génica de Mfn2 es de notable interés. En esta tesis, se ha donado el promotor humano de Mfn2 y se ha determinado que carece de caja TATA y se localiza en una isla CpG, lo que lo hace susceptible de ser regulado por metilación. En músculo esquelético posee al menos 6 inicios de transcripción en una ventana de 171 pares de bases. Estudios con genes reporteros han determinado que Spl podría tener un papel relevante dirigiendo a la maquinaria basal de transcripción para formar el complejo de preiniciación. La expresión de Mfn2 es mayor en tejidos con requerimientos energéticos elevados. Ensayos con genes reporteros han permitido identificar factores de transcripción que podrían ser responsables de la expresión dependiente de tejido. Se ha estudiado con detalle la inducción de Mfn2 en músculo esquelético y tejido adiposo marrón con la exposición al frío y tratamiento con agonistas de los receptores B3-adrenérgicos, condiciones ambas caracterizadaspor un elevado gasto energético. El aumento de expresión de Mfn2 en estas condiciones es mediado por PGC-1a el cual coactiva a ERRa que se une al promotor de Mfn2 en forma de monómero entre las bases -413 y -408. El incremento del potencial de membrana mitocondrial asociado a la expresión de PGC-1a es inhibido por la represión de la expresión de Mfn2. Mfn2 podría ser un efector crucial en la activación mitocondrial inducida por PGC-1 a. Se han aportado nuevas evidencias de la relevancia de Mfn2 en el control de la oxidación mitocondrial de substratos al mostrar una mayor expresión de Mfn2 en fibras musculares oxidativas que en fibras glucolíticas. La transcripción de Mfn2 aumenta en respuesta a incrementos en la concentración de calcio intracelular. Nuestros resultados sugieren que MEF2, el cual se une y activa al promotor de Mfn2, podría ser un efector de la cascada de señalización iniciada por el calcio citosólico. Los datos obtenidos indican que la expresión de Mfn2 en músculo esquelético se incrementan en condiciones de elevado gasto energético lo cual estimula la oxidación de substratos y provoca incrementos en el potencial de membrana mitocondrial. Dependiendo de la demanda celular de ATP, el potencial de membrana mitocondrial se disipa para producir ATP o generar calor.

Autor: ABDEEN ASHRAF M. A..
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMÁCIA.
Centro de realización: DE BARCELONA -CSIC.

Resumen: El gen leucina aminopeptidasa (LAP) se induce por herida y jasmonato. Estudios de linker-scan mutagénesis del promotor LAP identificaron dos nuevos elementos cis requeridos para la expresión inducida por JA. Estos elementos incluyen una caja MYB y el motivo T/G-box. Dos factores de transcripción del tipo bHLH (JAMYC2 y JAMYClO) que se unen a este gen fueron identificado. El silenciamiento de los genes JAMYC2 y JAMYCIO por VIGS, indicó una posible función redundante de estos factores de transcripción con otros factores MYC de la misma familia. La supresión estable mediante RNAi de la familia completa de genes resultó en un bloqueo en los niveles de expresión del gen LAP, demostrando una función de estos factores de transcripción como reguladores positivos de estos genes. El análisis microarray de las líneas silenciadas para la familia JAMYC reveló que estos factores regulan diferencialmente dos ramas en la ruta de sefialización de JA. Por una parte, JAMYC activa la expresión de genes inducidos en respuesta a herida y JA, tales como pin2, pinl y LAP, en tanto que regulan negativamente la expresión de genes inducidos en respuesta a JA y ET, tales como PR-I, PR-5 Y b-CHL e inducidos durante la reacción de defensa frente a patógenos. Los factores JAMYC así tendrían una función reguladora similar a la del gen AtMYC2 de Arabidopsis, ambos factores de transcripción jugando un papel clave en la activación de diferentes conjuntos de genes de defensa frente al ataque por insectos y la infección por patógenos. El silenciamiento por VIGS del gen LeMYB24 de tomate redujo la expresión del gen PR-I en respuesta al tratamiento por SA o la infección vírica. Los genes AtMYB24 y AtMYB57 de Arabidopsis poseen elevada homología con LeMYB24 y son inducidos por el tratamiento de JA. Mutantes de inserción en el gen AtMYB24 mostraron, en tiempos tempranos de inducción, unos niveles reducidos de expresión del gen PR-I en respuesta al tratamiento por SA. El silenciamiento por RNAi del gen AtMYB57 en el fondo mutante atmyb24 resultó en un bloqueo en la expresión del gen PR-I. La sobre-expresión de AtMYB24 en Arabidopsis llevó a la activación constitutiva de este gen. La proteína AtMYB15 se une a la caja MYB presente en el promotor LAP y es capaz de activar la expresión de este gen en experimentos de expresión transitoria en células BY2 de tabaco. La co-transfección de AtMYBl5 y los factores JAMYC resulta en un incremento en los niveles de activación de la construcción reportera -317LAP, indicando una interacción cooperativa entre AtMYB15 y las proteínas de JAMYC. Mutantes de inserción en el gen AtMYBl5 exhiben una expresión alterada de los genes regulados por JA y JAlET. Estos mutantes mostraron niveles reducidos del mensajero VSP en respuesta a JA, y niveles más elevados de mensajeros correspondientes a genes regulados por JAlET-, tales como PDFI.2 y PR-4, sugiriendo un papel clave de AtMYB 15 en la activación de los genes dependientes de JA y en la represión de los genes dependientes de JAlET-. Dicha función es probablemente ejercida a través de una interacción cooperativa con AtMYC2 o a través de una regulación directa del gen AtMYC2.

Autor: HERRERO RODRÍGUEZ LAURA.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Autor: PEDRAZA GONZALEZ NIEVES.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Autor: FERNANDEZ FERNANDEZ CRISTINA.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGÍCAS.
Centro de realización: CENTRO INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS CCSIC.

Resumen: El objetivo perseguido en este trabajo ha sido avanzar y profundizar en el conocimiento de la ruta de degradación del ácido fenilacético (PA) en Escherichia coli W En primer lugar se ha caracterizado la segunda etapa en la degradación de PA, la transformación de PA en fenilacetil-CoA (PA-CoA). Se ha demostrado por una parte, que los genes paaABCDE son todos necesarios para la hidroxilación del anillo aromático de PA-CoA, primer intermediario de la ruta, y por otro lado, que esta hidroxilación es dependiente de oxígeno. En segundo lugar se han estudiado el gen paaX, que codifica un represor que controla la expresión de los genes catabólicos. En este trabajo se ha confirmado que la proteína PaaX también está implicada en la represión de su propia expresión, y se ha observado que el PA-CoA es el inductor del sistema. La proteína PaaX es capaz de competir y desplazar la unión de la RNA polimerasa a la zona promotora. Se ha observado que los promotores de la ruta de degradación del PA no se pueden activar en anaerobiosis, porque no puede sintetizarse PA-CoA, ya que la PA-CoA ligasa pierde rápidamente su actividad en ausencia de oxígeno. En tercer lugar se ha estudiado la función del gen paaY que se encuentra contiguo al gen paaX La ausencia del gen paaY retrasa de forma significativa el crecimiento de E. coli en PA pero sólo cuando está presente el represor PaaX. Además las células deficientes en este gen no son capaces de activar de forma efectiva la ruta paa cuando la bacteria utiliza únicamente PA como fuente de energía. La proteína PaaY se ha hiperexpresado y purificado, comprobándose que es una metaloenzima trimérica que presenta actividad tioesterasa sobre algunos compuestos derivados de CoA.

Autor: LÓPEZ BARRAGÁN M. JOSÉ.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS CSIC.

Resumen: Los estudios realizados en esta Tesis han permitido la identificación y caracterización del potencial catabólico de Azoarcus sp. CIB, capaz de degradar anaeróbicamente (condiciones desnitrificantes) compuestos aromáticos tales corno tolueno y m-xileno. Por primera vez en el género Azoarcus se ha propuesto una ruta central de degradación anaeróbica de compuestos aromáticos vía benzoil-CoA y se han identificado los genes responsables de dicha ruta bioquímica, que se agrupan en un cluster, denominado bzd, organizado en un operón regulador, constituido por el gen bzdR, bajo el control del promotor PR y otro operón catabólico, bzdNOPQMSTUVWXYZ, bajo el control del promotor PN. Se ha diseñado una casete portadora de los genes bzd en un vector movilizable de amplio espectro de huésped con el objetivo de explorar el potencial de la ingeniería de rutas anaeróbicas, siendo ésta la primera casete que se describe en el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos. El gen bzdA codifica una benzoato-CoA ligasa involucrada en la primera reacción del catabolismo anaeróbico de benzoato y reconoce corno sustratos una mayor variedad de compuestos aromáticos que otras benzoato-CoA ligasas descritas hasta el momento, por lo que su hiperproducción en huéspedes heterólogos muestra interés biotecnológico para la síntesis de derivados de benzoil-CoA. La proteína reguladora BzdR constituye el primer represor transcripcional que se describe en el catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos. Este regulador transcripcional interacciona con tres regiones operadoras presentes en el promotor catabólico PN inhibiendo su actividad, habiéndose caracterizado, también por primera vez en catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos, la naturaleza de la molécula inductora, el benzoil-CoA. La novedosa estructura modular de la proteína BzdR, constituida por un dominio de tipo HTH-XRE típico de proteínas de unión a ADN y un dominio que presenta alta identidad con siquimato quinasas, hace de BzdR el primer miembro de una nueva subfamilia de reguladores transcripcionales.

Autor: ÁLVARO PÉREZ CRISTINA DE.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FRAMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El músculo esquelético es un importante tejido diana para la insulina y para el factor de crecimiento insulínico de tipo I IGF-I, tanto desde un punto de vista metabólico , fundamentalmente en la homeostasis glucídica, como en los procesos de diferenciación y regeneración muscular.La diabetes tipo 2 es un desorden metabólico progresivo, que se caracteriza por la incapacidad del organismo para almacenar y consumir la glucosa de forma apropiada , bien por una deficiencia de las células B del páncreas para secretar las cantidades necesarias de la hormona , o bien por una falta de respuesta de los tejidos periféricos a la acción de la insulina.De hecho , el músculo esquelético es el responsable de aprocimadamente el 80% de la utilización de la glucosa tras la ingestión de carbohidratos o la infusión directa del azúcar y es el tejido en el que se detectan los primeros indicios de un estado de resistencia a insulina, cuya principal consecuencia es una disminución en el transporte de glucosa al interior de la fibra muscular en respuesta a la hormona debido a múltiples alteraciones en la via de señalización de la insulina en este tejido.En este trabajo hemos descrito cómo el TNFA produce resistencia a insulina en el músculo esqueético , lo cual supone una disminución en la traslocación de GLUT4 y en el trasporte de glucosa en respuesta a insulina y la atenuación de la ruta de señalización de la hormona.Por otra parte, la regeneración muscular es un proceso fundamental tras determinadas lesiones , accidentes u otras patologías , por lo que, el conocimiento de los mecanismos moleculares y celulares que mantienen la plasticidad muscular permitá definir el potencial de adaptación del músculo a distintas situaciones y también , identificar nuevos genes y rutas de señalización implicadas en determinadas patologías.En este sentido , en este trabajo hemos estudiado los mecanismos moleculares que modulan la diferenciación muscular en diferentes situaciones , como la transformación por oncogenes Ras y la estimulación con factores de crecimiento , por ejemplo el FGF.

Autor: ROLLÍN TOLEDO RAQUEL.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: HOSPITAL CLÍNICO SAN CARLOS.
Centro de realización: HOSPITAL CLÍNICO SAN CARLOS.

Resumen: En este trabajo se detecto la expresión de los tránscritos de los receptores de los péptidos natriuréticos (NPRA, NPRB, Y NPRC), junto con la expresión de ARNm de ANP , BNP y CNP en la retina humana de sujetos controles, proporcionando evidencias de la existencia de un sistema natriurético local.Los niveles de expresión génica medidos por RT-PCR cuantitativa a tiempo real, mostraron que no existen deferencias significativas entre los diferentes subtipos de receptores de los péptidos natriuréticos en la retina humana de sujetos controles.La expresión de los péptidos natriuréticos se detectó por inmunohistoquímica en estructuras vasculares,gliales (astrocitos)y neurales de la retina adulta normal, lo que sugiere una función de los péptidos natriuréticos en preservar tanto la integridad vascular como la neural de la retina madura. En la Diabetes mellitus,la expresión del ANP retiniano varía en función del estado metabólico y del grado de isquemia retiniana en paralelo con los cambios de la expresión del GFAP en las capas más internas de la retina.Los más relevante de este estudio ha sido el hallazgo de que en la retinopatía diabética proliferativa la señal inmuorreactiva del ANP desaparece (en paralelo con una disminución de astrocitos)mientras que el tratamiento con láser aumenta la señal del ANP junto con la de la glía reactiva(astrocitos y células de Müller).Estos datos sugieren que el ANP podría ejercer una función antiangiogénica en la retinopatía diabética proliferativa posiblemente inhibiendo la producción del VEGF o la activación por este último factor de moléculas implicadas en la angiogénesis.

Autor: TORRES TORRES RAÚL.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLOGÍCAS (CSIC).

Resumen: La ataxia de Friedreich es una enfermedad neurodegenerativa causada por la expansión de las repeticiones GAA.TCC en el intrón 1 del gen FRDA.En esta tesis se ha estudiado el efecto de esta secuencia repetida sobre el avance de las horquillas de replicación y el proceso de recombinación en plásmidos de Escherichia coli.Hemos encontrado que se produce una atenuación de las horquillas cuando la secuencia (TTC)n actúa como molde de la hebra retrasada durante la replicación.Esta pausa tiene lugar en la zona previa a los tripletes.Efectos podrían ser explicados como consecuencia de la formación de un DNA tríplex dentro de las repeticiones como consecuencia del carácter homopurina.homopirimidina de la secuencia.La inestabilidad de las repeticiones, no parece ser debida sólo a la presencia de la pausa de la replicación,sino que parece haber otra u otras causas. Por otro lado,hemos encontrado que independientemente de la orientación , las repeticiones GAA.TCC inducen la acumulación de moléculas con forma de X,consistentes en dos moléculas plasmídicas unidas por una unión de tipo Holliday (HJ) localizada en las repeticiones.Esto podría estar relacionado con la capacidad del DNA tríplex para bloquear la migración de las uniones de Holliday. La resolución asimétrica de estas uniones de Holliday dentro de las repeticiones podría ser una fuente de inestabilidad común a las dos orientaciones.No obstante, no descartamos otras posibles causas del bloqueo de las uniones de Holliday como la formación asimétrica de las mismas dentro de las repeticiones o la heterogeneidad en el número de repeticiones entre los plásmidos que recombinan

Autor: HERNÁNDEZ ESCAREÑO JESÚS JAIME.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: El género Malassezia incluye levaduras lipófilas que tienen como hábitat principal la piel de una gran variedad de mamíferos y aves. Clásicamente se consideraba formado por dos especies, la especie lipodependiente M.furfur, características de la piel del hombre y la especie no lipodependiente M.pachydermatis, asociada a los animales. En la última revisión taxonómica realizada del género, el número de especies lipodependientes de escritas se ha incrementado, incluyéndose un total de seis: M.furfur, M.globosa, M.obtusa, M.restricta, M.slooffiae y M.sympodialis. Malassezia pachydermatis está considerada clásicamente como zoófila. No obstante, en los últimos años se han descrito infecciones sistémicas en el hombre. M.pachydermatis se asocia normalmente con otitis externa y diferentes tipos de dermatitis en los animales domésticos, especialmente en perros. Actualmente ha sido aceptado que este microorganismo juega un papel significativo en la producción de enfermedades en animales cuando existe un desequilibrio en el microclima de la piel. Existen pocos estudios publicados sobre la presencia y distribución de las diferentes especies lipodependientes del género Malassezia que utilicen la última revisión del género. Recientemente se han propuesto cuatro nuevas especies, de las cuales M.dermatits, M.nana y la tentativamente denominada "Malassezia equi" presentan características morfológicas, fisiológicas y genéticas similares a M.simpodialis. La identificación rutinaria de estas especies lipodependientes se basa fundamentalmente en el estudio de la utilización e distintos ésteres depolioexietilensorbitano. No obstante, estas pruebas son tediosas de realizar y en algunos casos los resultados obtenidos son difíciles de interpretar, existiendo dificultad en obtener una correcta identificación. El objeto de esta tesis doctoral ha sido el estudio de la diversidad genética de cepas pertenecientes a Malassezia spp.aisladas de animales domésticos mediante técnicas del DNA, incluyendo: 1,- La caracterización molecular de cepas de M.pachydermatis aisladas de diferentes animales domésticos sanos y con alteraciones dermatológicas mediante la técnica de RAPD (polimorfismo del DNA amplificado aleatoriamente). 2,- La caracterización molecular de cepas lipodependientes aisladas de diferentes animales domésticos próximas a la especie tipo de M.sympodialis, mediante técnicas del DNA basadas en el análisis comparativo de las secuencias de los fragmentos D1/D2 26S e ITS-2.8S del DNA ribosomal. Para la caracterización molecular de M.pachydermatis se analizaron un total de 55 cepas y la cepa neotipo CBS 1879. Con el cebador OPT-20 pudimos diferenciar 4 genotipos. El genotipo predominante (genotipo I) se observó en cepas aisladas de todas las especies animales y en diferentes localizaciones anatómicas. Fue el único genotipo observado en gastos, caballo, cabra y cerdo. Los otros tres genotipos se detectaron sólo en cepas recuperadas del oído externo de perros. Los genotipos II y IV se observaron en perros con oititis mientras que el genotipo III de perros sanos. Para la caracterización molecular de las cepas lipodependientes próximas a la especie tipo de M.sympodialis, se han analizado un total de 20 cepas. El análisis filogenético de las secuencias de ambas regiones (D1/D2 e ITS-5.8S) nos permitió agrupar las cepas en cuatro grupos distintos. El grupo I incluyó cepas diferentes especies de animales domésticos (caballo, cerdo y oveja) y la cepa tipo de M.sympodialis. El grupo II incluyó cepas de c 8 aballo, 4d9 agrupándose con la secuencia AJ305330 de "M.equi". El grupo III estaba formado por cepas aisladas principalmente de cabras. El grupo IV estaba formado por cepas aisladas de gatos, agrupándose con la secuencia de M.nana AB075224. No está claro si estas diferencias genéticas son suficientes para definir nuevas especies o si sólo muestran una variación genética entre cepas de diferentes orígenes dentro de M.sympodialis, que están en proceso de diferenciación y probablemente adaptación a hospedadores animales específicos.

Autor: GOMEZ MALDONADO JOSEFA.
Año: 2004.
Universidad: MÁLAGA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Se ha analizado el patrón de expresión de los genes codificantes para las glutamina sintetasa, GS1 y Gs1b de pino durante el desarrollo primario, determinándose que se presentan una localización tisular y celular no solapante, apoyando la hipótesis de que ambas ioenzimas realizan una función metabólica diferentes. Por una lado se ha determinado que GS1b es la enzima que está involucrada en la (re)asimilación del nitrógeno contenido en las proteínas de reserva de la semilla y en estadios planturales, su localización vascular indica un papel de esta enzima en la biosíntesis de glutamina para el transporte a otras partes de la plántula. La expresión de GS1a asociada al parénquima clorofílico, sugiere su implicación en el aporte de compuestos nitrogenados para la función fotosintética. Se han analizado las estructuras de los promotores de ambos genes GS1 de pino, abordándose su estudio con la utilización de distintas aproximaciones, tales como expresión transitoria en sistema homólogo y heterólogo, así como los ensayos de retraso en gel. RESPECTO A GS1A: Se ha determinado que su región distal promotora presenta una secuencia AT1 y AT2 de unión para factores nucleares, Estas cajas AT son esenciales para la actividad promotora y podrían funcionar en coordinación positiva con el elemento poli-CT presente en la región líder. Se ha propuesto la funcionalidad de estos elementos AT en al activación transcripcional de GS1a mediada por luz. Se ha puesto de manifiesto también la existencia de elementos negativos que afectan a la expresión del gen localizados en la zona central de su estructura promotora. RESPECTO A GS1B: Utilizando el procedimiento de análisis de la expresión transitoria en protoplastos de pino tratados hormonalmente, se ha podido delimitar una región implicada en la regulación GS1b por giberelinas, la cual puede enmarcarse en el contexto del papel de esta hormona en el desarrollo del embrión, coordinada con las enzimas proteolíticas encargadas de d degradar las proteínas de reserva de la semilla. La estructura promotora de GS1b presenta una secuencia AT funcional, la cual podría estar implicada de modo accesorio en la funcionalidad de la caja de primigenias, incrementando la accesibilidad de dicha caja a sus específicos factores de transcripción. Se ha determinado la existencia de una región de regulación negativa en la zona más distal de la estructura promotora analizada, la cual afecta a la expresión del gen específicamente en cotiledones. Por último, los resultados obtenidos utilizando diferentes aproximaciones moleculares han permitido proponer que tanto Myb1 como Myb4 pueden regular la expresión del gen GS1b de forma conjunta a la regulación del metabolismo de los fenilpropanoides lo que propiciaría una eficiente (re)asimilación del amonio liberado en la síntesis de lignina en el tejido vascular. Esta regulación coordinada parece que se lleva a cabo por la interacción de los factores Myb con elementos AC específicos presentes en el promotor de GS1b.