BIOLOGIA MOLECULAR, 2

Autor: ZAPATA GONZÁLEZ FERNANDO.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE QUÍMICA Y FÍSICA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: El ácido docosahexaenoico, un PUFA omega-3, se ha relacionado con efectos inmunosupresores en linfocitos, monolitos y macrófagos pero no existían estudios sobre sus efectos en las células dendríticas (DCs). Por ello se diferenciaron en presencia de DHA monocitos hacia DCs. Las células tratadas con el ácido graso mostraron cambios fenotípicos divergentes en función del estadio de madurez de las mismas. Así, en estadio inmaduro, se produjeron incrementos de expresión de CD83, HLA-DR y CD36 y disminución de CD1a y CD80. Sin embargo, en estadio maduro, CD83, CD86 y HLA-DR sufrieron descensos en su expresión con respecto a los controles. CD80 y CD1a de nuevo presentaban una expresión disminuida y la de CD36 se encontraba aumentada. Al medir la capacidad de activación de la proliferación linfocitaria de estas células se encontró que esta se encontraba disminuida. La secreción de IL-10 e IL-12 también había disminuido. Este conjunto de efectos era dependiente de la concentración de DHA. El DHA era capaz de desarrollar algún tipo de efecto inmunosupresor en las DCs. Se realizaron experimentos similares con otros ácidos grasos: EPA, ácido linoleico (LA) y ácido oleico. Con EPA y LA se obtuvieron resultados similares a los mostrados por el DHA cualitativamente pero no cuantitativamente. El DHA era el ácido graso más potente y afectaba tanto al fnotipo como a la capacidad secretora de citocinas y activadora de la proliferación linfocitaria en DCs. Estos resultados eran similares a los obtenidos por otros autores en los tratamientos de DCs con activadores de PPARy lo cual sugería para el DHA una posible actuación a través de este receptor nuclear. Sin embargo, el hecho de que el DHA sea un activador de PPARy pobre en comparación con EPA, LA o Rosiglitazona sugirió la presencia de otras vías de activación. En concreto, RXR, con el cual se ha demostrado que el DHA es capaz de interactuar. Se trataron DCs con concentraciones en el rango nanomolar de 9cRA, un activador de RXT, obteniéndose que este retinoide era capaz de interferir en la maduración normal de la DC de forma que se obtenía resultados fenotípicos extraordinariamente similares a los producidos por el DHA. También la capacidad de estimulación de la proliferación linfocitaria estaba disminuida. En cambio, las DCS tratadas con 9cRA mostraron una secreción disminuida de IL-12 y normal de IL-10. La activación de PPARy:RXR simultáneamente a través de ambos monómeros ha sido relacionada con efectos aditivos, sinérgicos o complementarios en muchos tipos celulares. Se cree que esto es debido a la unión de moléculas coactivadoras complementarias al heterodímero. La adición simultánea de Rosiglitazona y 9cRA a las DCs mostró efectos fenotípicos aditivos indicando que probablemente 9cRa estaba actuando a través del hetreodímero. Se realizaron experimentos similares combinando el DHA con 9cRA y el DHA con la Rosiglitazona. La combinación con Rosiglitzona mostró cambios mucho más importantes lo cual sugería que el DHA actuaba principalmente uniéndose a RXR en el heterodímero. Finalmente, se añadió un inhibidor específico de PPARy a las células dendríticas: GW9662; el cual fue capaz de bloquear los efectos producidos por el DHA, la Rosiglitazona y el 9cRA. Además, el inhibidor por sí mismo alteraba por completo el proceso de maduración de las células dendríticas implicando que PPARy debe desarrollar un papel indispensable en el proceso de maduración de la DC y no sólo actuar como un activador de la inmunosupresión y también que el DHA, probablemente, actúe a través del monómero RXR del heterodímero PPARy:RXR en las Dcs.

Autor: HORCAJADA GARRO CRISTINA.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: Las glucógeno y las almidón sitasas son glicosiltransferasas que catalizan la transferencia con retención de la configuración de residuos glucosilo al extremo no reductor de una cadena creciente del glucano alfa-1,4. Este proceso es central en el metabolismo energético de la mayoría de organismos vivos. En esta tesis hemos descrito la estructura cristalográfica de la glucógeno sintasa de Pyrococcus abyssi, un enzima que puede usar tanto UDP- como ADP-glucosa como donadores de glucosilo. A pesar de que la tecnología de las subunidades de este enzima son parecidas a las descritas recientemente para la sintasa bacteriana de Agrobacterium tumefaciens, su organización molecular presenta diferencias muy considerables. La sintasa de arqueon es homotrimérica en el cristal y en solución, como lo muestran los experimentos de ultracentrifugación analítica y microscopía electrónica. La disposición de las subnidades confiere a la molécula una forma triangular evidente. La comparación de la proteína de arqueon con otras glicosiltransferasas que actúan con retención de la configuración nos han permitido identificar los residuos que determinan la especificidad por el donador de glucosilo, y proponer un modelo estructural que permite explicar las bases de la regulación de las glucógeno sintasas eucariotas.

Autor: BRAVO ARRANZ MARIA.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN (AESA).

Resumen: Las aminas biógenas presentes en alimentos son originados mediante la actividad descarboxilasa de un gran número de microorganismos. Su concentración y naturaleza está en función de numerosos factores, habiéndose detectado cantidades significativas de estos compuestos en prácticamente todos los grupos de alimentos, especialmente en pescados. La ingesta de altas concentraciones de aminas biógenas puede dar lugar a una intoxicación que, cursa con síntomas similares a alergias y otras intoxicaciones de tipo alimentario (dolor de cabeza, diarreas, urticaria, etc.9. Se desconoce con certeza el alcance de esta toxemia, aunque se sospecha que su incidencia es mucho mayor de la oficialmente reconocida. Las aminas biógenas más comúnmente encontrados en pescados son: histamna, cadaverina, putrescina, espermina y espermidina. A pesar de que es habitual encontrar varias de ellas en un mismo alimento, y de que no es conocida su toxicidad ni el mecanismo por el cual actúan, se considera a la histamina como el principal agente causal de dicha intoxicación. Sin embargo, hay evidencias de que la presencia conjunta de varios amina potencia el efecto tóxico de la histamina. Una de las hipótesis planteadas al respecto implica la liberación endógena de histamina a partir de células del sistema inmune. En el presente trabajo hemos estudiado la histamina, cadaverina, putrescina espermina y espermidina desde dos puntos de vista: 1,- La secuencia citotóxica que presentan estas aminas asociadas a pescados y su efecto potenciador en mezclas binarias con histamina utilizando dos líneas celulares: RTG-2 y Chang-Liver. 2,- La activación de las células basófilas mediadas por estas amina y sus mezclas binarias mediante citometría de flujo. A partir de nuestros estudios, hemos concluido que, de entre todas las aminas seleccionadas, la espermina y espermidina han demostrado la mayor citotoxicidad y capacidad de activación de las células basófilas. Las mezclas compuestas por histamina y el resto de las miana han manifestado asimismo un claro efecto potenciador en cuanto a dicha activación con respecto a sus respectivas concentraciones individuales.

Autor: ANTÚNEZ RODRIGUEZ CRISTINA.
Año: 2004.
Universidad: MÁLAGA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Algunas patologras cutáneas como la dermatitis atópica (DA) o la psoriasis empeoran con el estrés y este fenómeno se ha asociado con la liberación local de neuropéptidos (NPs). Los NPs, como la sustancia P (SP), péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), somatostatina y neuropéptido Y (NY) moduran o inician procesos inflamatorios presentes en la DA. Sabemos que existen citoquinas proinflamatorias que inician y regulan estos procesos inflamatorios, y por tanto, cabría esperar que los NPs influyan en la producción de las mismas. En el trabajo realizado en esta tesis concluimos que en ros cultivos in vitro de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con dermatitis atópica, los neuropéptidos son capaces de Inducir cambios en la producción de citoquinas de los linfocitos T. Estos cambios son diferentes en aquellos que presentan lesiones agudas con respecto a los que presentan lesiones crónicas, actuando de manera preferencial en la subpoblación de linfocitos T CLA+. Por otro lado, en los linfocitos se expresan receptores que traducen esta interacción ligando-receptor en una cascada señalizadora que produzca una respuesta. Los resultados de este trabajo indican que en la dermatitis atópica existe una regulación del receptor del CGRP, ya que detectamos una disminución del componente CRLR, no encontrándose diferencias entre los pacientes con lesiones agudas o crónicas. El estudio de la expresión del receptor SSTR3 no refleja cambios significativos en esta patología. Tras la separación de los linfocitos memoria CD45RO+ y de los linfocitos T vírgenes CD45RA+ de pacientes con DA crónica, se demuestra que el efecto de los neuropéptidos se produce fundamentalmente en los linfocitos T memoria y dentro de estos fundamentalmente en las células CLA+. El efecto producido por los neuropéptidos depende del patrón de citoquinas previo de las células. En el caso de células con patrón Th2 los neuropéptidos producen un aumento de IFN-g y en el caso de un patrón Th1 producen un aumento de IL-13. Todo esto indica un efecto inmunomodulador de los neuropéptidos en la dermatitis atópica. Esta influencia de los NPs en la enfermedad, abre nuevos campos de investigación encaminados a la búsqueda y desarrollo de fármacos que permitan controlar esta patologra.

Autor: CÁMARA NAVARRO YOLANDA.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA - UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: La proteína desacopladora mitocondrial UCP3 pertenece a la superfamilia de transportadores de aniones mitocondriales y se expresa preferencialmente en músculo esquelético. Su función fisiológica es desconocida, aunque in vitro se sabe que es capaz de desarrollar una actividad desacoplante. Comprobamos que la presencia de niveles elevados de UCP3 en células no musculares, confiere a las mitocondrias un comportamiento bioquímico propio de la presencia de una proteína desacopladora funcional (desacoplamiento inducido por ácidos grasos e inhibible por GDP). En esta condiciones, UCP3 no induce la apoptosis pero sensibiliza las células al estímulo apoptótico con implicación mitocondrial (staurosporina). Las células musculares en cultivo adquieren resistencia a la activación de la apoptosis al diferenciarse a miotubos, una disminución transitoria del contenido en ROS a lo largo de la diferenciación, y una disminución en la expresión de genes codificantes para ezimas antioxidante y en los niveles de glutatión reducido. La activación e vías apoptóticas (caspasa-3, caspasa-9) por staurosporina se da en paralelo a un aumento de ROS, pero este último fenómeno no es necesario para la activación de los procesos apoptóticos. La inducción de niveles altos de expresión de UCP3 en células musculares diferenciadas, vía transferencia génica con un vector adenovírico, disminuye de forma moderada el potencial de membrana pero no repercute en los niveles d ROS ni en el estrés oxidativo en general. La presencia de UCP3 no influye en la generación e ROS en respuesta a staurosporina y no protege sino que incluso sensibiliza moderadamente la activación de caspasas en respuesta a staurosporina. Los ácidos grasos, especialmente el palmitato, aumentan los nivele de ROS en células musculares diferenciadas (miotubos). La presencia de UCP3 produce una aumento moderado de ROS y de sensores celulares de estrés oxidativo en el contexto celular muscular. Su presencia no protege a las células del estímulo apoptótico sino al contrario, las sensibiliza. Ello debe producirse necesariamente por mecanismos distintos a posibles efectos sobre ROS y podría implicar la interacción indirecta (vía consecuencias bioenergéticas) o directa de UCP3 con la maquinaria que regula a nivel mitocondrial el proceso de apoptosis.

Autor: ROMERO GARCIA M. INMACULADA CONCEPCIÓN.
Año: 2004.
Universidad: CÓRDOBA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS . UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA.

Resumen: La contaminación creciente a la que está siendo sometido el medio natural es un problema que requiere urgente solución. Entre los agentes químicos contaminantes se encuentran oxianiones tóxicos como arseniato y arsenito utilizados como plaguicidas, nitratos, empleados como fertilizantes y otros oxianiones, procedentes de procesos industriales, tales como el telurito, seleniato, clorato, entre otros. Estos compuestos se acumulan en el suelo, de donde pasan a las capas freáticas y a las aguas continentales, imposibilitando su uso para el consumo. Se ha purificado y caracterizado la nitrato reductasa periplásmica de Rhodobacter sphaeroides DSM158. Además, se ha caracterizado el metabolismo y la resistencia a telurito, arseniato, arsenito, seleniato, selenita, clorato y perclorato en las bacterias Gram negativas fotosintéticas Rhodobacter sphaeroides DSM158 que posee una nitrato reductasa periplásmica (Nap+), Rhodobacter capsulatus E1F1 cuya nitrato reductasa es asimiladora (Nas+) y Rhodobacter capsulatus B10 que carece de nitrato reductasas (Nap-, Nas-), y en la bacteria Gram positiva no fotosintética Rhodococcus sp. RB1 (Nas+). También se estudió la posible implicación de las nitrato reductasas de los organismos empleados en la reducción de estos oxianiones, ya que se ha descrito que dichas enzimas pueden catalizar la reducción de oxianiones. Finalmente, se han puesto a punto métodos colorimétricos de medida de concentración de algunos de estos oxianiones. La Nap de R. sphaeroides puede reducir clorato, telurito, seleniato y selenita. Esta bacteria posee las reductasas específicas para cada uno de los oxianiones empleados excepto para perclorato, y al igual que la bacteria Rhodococcus sp. RB1, posee telurito y selenita reductasas respiradoras. La bacteria Rhodococcus sp. RB1 también respira (per)clorato. Esta estirpe en condiciones aeróbicas tolera arseniato, seleniato y (per)clorato, pero no los reduce. No crece con selenito pero posee una telurito reductasa. R. capsulatus E1F1 y B10 poseen telurito, seleniato, selenita y arseniato reductasas. Son muy sensibles a arsenito y respiran arseniato, seleniato y selenito. La estirpe B10 también respira perclorato.

Autor: IVORRA IVORRA CARMEN.
Año: 2004.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOMEDICINA DE VALENCIA-CSIC.

Resumen: Los protooncogenes de la familia AP-l c-fos y c..Jun desempefian un papel importante en el control de la prQliferaci6n celular de los organismos eucariotas. Su regulación está gobernada por multitud de mecanismos, entre los que cabe destacar las interacciones con otras proteinas. El objetivo principal de los trabajos efectuados en esta tesis doctoral ha sido la identificaci6n de nuevas dianas de interacción de la proteína c-Fos. Nuestro abordaje experimental nos ha permitido identificar la interacci6n entre c-Fos y las proteinas de la matriz nuclear lamina A/ C e INMP (intranuclear matrix protein) , y caracterizar la interacción c-Fos/lamina A/C. Mediante ensayos in vitro herrtos identificado los dominios responsables de la formación de heterodímeros c-Fos/lamina A/C. Estudios de expresión y localización subcelular por inmunofluorescencia en celulas primarias de miocito liso vascular y en células humanas HeLa nos han permitido demostrar su colocalización. Además hemos analizado Ios efectos de esta interacción sobre la actividad de c-Fos y sus consecuencias sobre la capacidad proliferativa de células de mamífero.

Autor: GIL MORRIÓ MARÍA JOSÉ.
Año: 2004.
Universidad: POLITÉCNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: Dep. Biotecnologia.
Centro de realización: Universidad Politécnica de Valencia.

Resumen: La comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la resistencia de la planta frente a patógenos biotrofos es un campo de investigación complejo y en expansión donde se impone la identificación de nuevos reguladores. Previamente se había descrito en nuestro laboratorio el gen P69C que codifica una proteasa con homología a subtilisinas y cuya expresión se induce en el transcurso de la interacción planta-patógeno. Con el fin de estudiar nuevos componentes de la planta implicados en la señalización de la respuesta defensiva, se procedió al escrutinio de mutantes de Arabidopsis thaliana que de forma constitutiva y sin la existencia de ningún estímulo externo se encontrara activada la expresión del gen GUS dirigida por el promotor P69C. En la presente memoria de tesis se describe ampliamente la identificación y caracterización del mutante, csb3 (constitutive subtilisin3). Las plantas csb3 poseen elevados niveles de ácido salicílico (SA) y además expresan genes dependientes de la ruta de SA tales como PR-1, PR-2 y GST6. Por otra parte, el mutante csb3 exhibe una elevada resistencia al oomiceto patógeno Hyaloperonospora parasitica de naturaleza biotrofa y a la bacteria patógena también biotrofa Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000 (Pst) DC3000. Sin embargo, la resistencia a patógenos necrotrofos tales como Botrytis cinerea y Plectosphaerella cucumerina permanece inalterada en las plantas csb3. Para analizar la participación de los distintos componentes de la ruta de señalización dependiente de SA en la manifestación del fenotipo de resistencia de csb3, se procedió al análisis epistático entre csb3 y pad4, sid2, eds5, nahG, npr1, dth9 y cpr1. Estos estudios indican que la elevada resistencia frente a patógenos biotrofos de las plantas csb3 requiere de todos y cada uno de los componentes de la ruta de señalización dependiente del SA estudiados. El gen CSB3 identificado por clonaje posicional codifica la 1-hidroxi-2-metil-2-butenil 4-difosfato (HDS) sintasa. Esta enzima controla uno de los pasos finales de la biosíntesis del isopentenil difosfato (IPP) de la ruta del 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP) que acontece en el cloroplasto. La expresión de CSB3 en plantas wt se reprimen parcialmente en respuesta a la infección por Pst DC3000. Además, a través del aislamiento y la caracterización de supresores extragénicos del mutante csb3-1. junto con la complementación farmacológica con fosmidomicina (un inhibidor de la rura MEP) del fenotipo de resistencia de las plantas csb3-1, proponemos que CSB3 podría funcionar como un regulador negativo de la ruta de señalización dependiente del SA que media la resistencia a patógenos biotrofos. Por otra parte, las plantas csb3-1 presenta niveles de expresión de los genes que codifican proteasas con homología a subtilisinas superiores al registrado para plantas wt. Estos dos genes csb3-1 presenta niveles de expresión de dos genes que codifican proteasas con homología a subtilisinas superiores al registrado para plantas wt. Estos dos genes denominados AtSBT3.3 y AtSBT3.5 se caracterizan por una expresión que se induce de forma temprana en respuesta a Pseudomonas syringae y Plectospharella cucumerina así como tras tratamiento con H2O2. Por el contrario, su expresión es completamente independiente del SA. La pérdida de función del gen AtSBT3.3 provoca un fenotipo de hipersusceptibilidad a patógenos biotrofos. Estas evidencias señalan la implicación de AtSBT3.3 y AtSBT3.5 en el mecanismo de la resistencia frente a patógenos biotrofos.

Autor: BARRERO SANCHEZ JOSE MARIA.
Año: 2004.
Universidad: MIGUEL HERNÁNDEZ DE ELCHE.
Centro de lectura: CAMPUS DE ELCHE.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOINGENIERIA.

Resumen: La salinización de los suelos cultivados es uno de los mayores obstáculos a los que se enfrenta la agricultura. El aislamiento y la caracterización de mutantes que manifiesten alteraciones en sus respuestas a la salinidad, con el objetivo de identificar los correspondientes genes y eventualmente manipularlos, podría aportar soluciones a este problema. Con la intención de contribuir a la resolución de este problema, se aislaron en el laboratorio de J.L. Micol estirpes mutantes de Arabidopsis thaliana capaces de germinar en presencia de altas concentraciones salinas. A partir del escrutinio de 675.500 semillas, se aislaron 17 líneas mutantes que manifestaban germinación halotolerante, y fueron asignadas a 5 grupos de complementación a los que se denominó SALOBREÑO1 a 5 (SAÑ1 a 5). Hemos caracterizado a niveles morfológico, molecular y fisiológico 15 mutantes de Arabidopsis thaliana, á de ellos aislados anteriormente en el laboratorio de J.L. Micol en base a su germinación halotolerante. Estos mutantes pertenecen a tres grupos de complementación (SAÑ1, SAÑ3 y SAÑ4). Hemos demostrado que estos tres genes SAÑ codifican enzimas implicadas en la síntesis del ácido abscísico (ABA), lo que confirma la importancia de esta fitohormona en la percepción del estrés salino y sugiere que la manipulación de su ruta biosintética podría permitir la modulación de la halotolerancia en las plantas. Hemos clonado posicionalmente las mutaciones sañ1, demostrando que el gen SAÑ1 es ABA1, cuyo producto es la zeaxantina epoxidasa, la enzima que cataliza las primeras etapas de la ruta de síntesjs del ABA. Hemos caracterizado estructuralmente nueve alelos aba1, y correlacionado su naturaleza molecular con sus efectos fenotípicos. El análisis de su fenotipo morfológico, celular y fisiológico sugiere que el ABA endógeno promueve el desarrollo vegetativo en ausencia de estrés. Los mutantes aba1 manifiestan desetiolación cuando son cultivados en oscuridad, un rasgo que no se aprecia en otros mutantes deficitarios en ABA. Esto sugiere que la zeaxantina, el intermediario de la ruta del ABA que se acumula en los mutantes aba1, afecta la escotomorfogénesis. Hemos clonado posicionalmente los genes SAÑ3 y SAÑ4, que resultaron ser ABA2 y ABA3. El gen ABA2 codifica una deshidrogenasa de alcoholes de cadena corta implicada en la síntesis de ABA, y ABA3 la sulfurasa de un cofactor de molibdeno necesario para una de las enzimas de la ruta de síntesis de esta hormona. Hemos caracterizado estructuralmente dos alelos mutantes presumiblemente nulos del gen ABA2, así como cuatro alelos mutantes del gen ABA3, dos de ellos parcialmente. El estudio de su fenotipo morfológico y fisiológico confirma que el ABA endógeno es un promotor del crecimiento. Hemos analizado cuantitativamente la expresión de los genes ABA 1, ABA2, ABA3, AAO3 y NCED3, todos ellos implicados en la biosíntesis del ABA, en los mutantes aba1-101, aba2-14, aba3-101 y aa03-2, así como en su ancestro silvestre Col-O. También hemos analizado la respuesta de estos genes al NaCI y el ABA, lo que nos ha permitido confirmar la existencia de un mecanismo de autorregulación positiva en la ruta biosintética del ABA, llevada a cabo fundamentalmente por los genes ABA 1 Y NCED3. Concluimos también que el elemento clave de la percepción del estrés salino es el gen NCED3. Hemos comprobado además que la sensibilidad al NaCI de varios ecotipos de Arabidopsis thaliana durante la germinación se correlaciona con la inducibilidad de la expresión del gen NCED3 en respuesta a esa sal.

Autor: GARCIA SACRISTAN ANA.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE CC. BIOLÓGICAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CC. BIOLÓGICAS.

Resumen: Uno de los objetivos del laboratorio donde se ha llevado a cabo el presente trabajo de Tesis es la identificación de genes implicados en la diferenciación eritropoyética utilizando como modelo de estudio el sistema de diferenciación inducible de células MEL. Mediante una librería diferencial de cDNA de células MEL pre-diferenciadas se ha identificado el gen cIklSTY como un gen que activa su expresión en las etapas tempranas de la diferenciación. ClklSTY es una proteína quinasa capaz de fosforilar residuos de serina, treonina así como de tirosina. Mediante splicing alternativo del exón 4, c1k1STYes capaz de generar dos transcritos. La inclusión del exón 4 da lugar a una proteína catalíticamente activa, mientras que la exclusión del exón genera una isoforma truncada. En la presente Tesis Doctoral se ha demostrado que clk/STY así como los otros miembros de la familia c1k (clk2, cIk3 YcIk4), aumentan su expresión en células MEL diferenciadas. Mediante ensayos de RT-PCR se ha observado que el aumento de expresión es causado tanto por el transcrito completo como por el truncado. En el caso de CklSTY, se ha detectado un cambio en la relación de los productos de :-,plicing.Así, en células no diferenciadas y en las primeras etapas de la diferenciación el transcrito completo es mayoritario, sin embargo, en las etapas finales existe mayor expresión del transcrito truncado. Asimismo, se ha demostrado que el aumento de exclusión del exón 4 es independiente de la acción del agente inductor y está relacionado directamente con el grado de diferenciación de las células. Mediante estudios in silico se han localizado sitios consenso de unión de las proteínas reguladoras del If)/¡cing alternativo, las proteínas SR y PTB, en lo intrones que flanquean el exón 4 y en el propio exón 4 Mediante ensayos con transfectantes estables que sobreexpresan clk/STY se ha demostrado que la exclusión del exón 4 de clk/STY se favorece a lo largo de la diferenciación de células MEL, aún cuando se tuerza la expresión exógena. Estos resultados sugieren que CklSTY podría contribuir al control de la diferenciación eritropoyética a través de un mecanismo que implicaría un balance entre ambas isoformas. Se ha corroborado, en células MEL, que la localización de clk/STY, así como su sustrato, la proteina SC-35, está relacionado directamente con el grado de fosforilación. En células MEL prediferenciadas la localización de ambas proteínas sigue un patrón difuso c'bincidiendo con una mayor presencia de la forma catalíticamente activa. En células MEL diferenciadas la localización de clklSTY y SC-35 es mayoritariamente en speckles coincidiendo en este caso con el aumento de la proteína truncada. Por otro lado, se ha identificado y aislado una nueva isoforma de cIk4 que contiene una .secuencia adicional de 59 pb. Por sus características, la secuencia ha sido reconocida como un exón que puede sufrir 8plicing alternativo generando dos nuevas isoformas de clk4. Estudios in si/ico han permitido localizar un posible marco de lectura en el nuevo exón que en caso de ser utilizado in vivo daria lugar a una proteína que conservaría el dominio quinasa de clk4 modificando parte del dominio N-terminal.

Autor: RODRIGUEZ SÁNCHEZ JOSANA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID.
Centro de lectura: DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR . FACULTAD DE CLENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Autor: LLEDÓ BOSCH M. BELÉN.
Año: 2004.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Haloferax mediterranei es un microorganismo halófilo extremo clasificado dentro del Dominio Archaea. Este mircroorganismo es capaz de crecer en medio mínimo con glucosa como única fuente de carbono y nitrato o nitrito como única fuente de nitrógeno. Hfx. Mediterranei manifiesta una elevada versarilidad fisológica. Cuando la disponibilidad de oxígeno en el medio es baja o nula, esta archaeon es capaz de crecer empleando NO3-como aceptor terminalde la cadena de transporte de electrones. A pesar del reciente número de genomas secuenciados no existe hasta el momento identificado ningún gen implicado en la asimilación del NO3- en arqueas. En este trabajo, por primera vez para un organismo Archaea, se han obtenido , secuenciado y analizado los genes para las Nas (nasA),NarK (nasB), MobA (nasC) y Nir (nasD). Estos genes se encuentran organizados en un operón que contiene los genes nasABC y otro monocistrónico. nasD , que se encuentran controlados por diferentes promotores. La regulación de la expresión está controlada a nivel transcripcional por sistemas generales, que corresponden a la disponibilidad de una fuente preferencial de nitrógeno y un control específico, que responde a la disponibilidad de NO3-/NO2-. Con el fin de comprobar la utilidad de la expresión heteróloga de enzimas halófilas para obtener elevadas cantidades de proteína se empleó la Nir de Hfx. Mediterranei. La purificación y caracterización de la enzima recombianate revelaron que sus propiedades son prácticamente idénticas a la enzima nativa. Para completar los estudios moleculares del metabolismo del NO3-en Hfx. Mediterranei se han secuenciado y analizado los genes implicados en la respiración del NO3- cuyas características son propias de organismos desnitrificantes. Se ha comprobado que la regulación ocurre a nivel transcripcional siendo la ausencia de O2 y la presencia de NO3- los activadores de la expresión. Así mismo, hemos purificado y caracterizado la Nar partiendo de células cultivadas en condiciones microaerófilas y presencia de NO3-. Los resultados obtenidos sugieren que la enzima que hemos caracterizado es una nitrato recuctasa respiratoria de membrana.

Autor: SALVÀ VILA LLUÍS.
Año: 2004.
Universidad: GIRONA.
Centro de lectura: Universidad de Girona.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE GIRONA.

Resumen: RESUMEN Esta tesis se centra en la caracterización funcional de una proteína de choque de calor de bajo peso molecular (Small Heat Shock Protein - sHSP) de clase I de alcornoque corchero en lo que se refiere a la capacidad de proteger las células del estrés y a estabilizar las membranas. Las sHsps son proteínas que se expresan en condiciones de estrés celular. Aunque algunos aspectos funcionales de las sHsps son conocidos, nuestro trabajo aporta nuevas informaciones sobre el papel de las distintas regiones de la proteína, en especial de la región N-terminal. El objetivo concreto de este trabajo es determinar la función termoprotectora de QsHsp17.4-CI en un modelo bacteriano y analizar la importancia de las distintas regiones de la proteína en dicha función. Con esta finalidad se han diseñado dos proteínas parciales derivadas de QsHsp17.4-CI: una a la que le falta la región N-terminal (C105) y otra con prácticamente todo el dominio -cristalino deleccionado (N61) y una tercera, derivada de QsHsp10-CI, a la que les falta la mitad del dominio -cristalino (Hsp10). También se estudia la posible capacidad estabilizadora de membranas y la capacidad de modificar la expresión de otras Hsps cuando se expresa de forma heteróloga. Nuestros resultados demuestran que la expresión de QsHsp17.4-CI protege las células de E.coli del estrés térmico así como que la región N-terminal y la región consensus II del dominio -cristalino son imprescindibles para la función de protección. En relación a un posible papel en las membranas, estudios de localización subcelular muestran que QsHsp17.4-CI colocaliza con la fracción membranosa y que la región N-terminal es necesaria para dicha colocalización. Sin embargo, no se ha podido demostrar que la localización en la membrana esté asociada a un efecto protector de ésta: en ningún caso la sobreexpressión de las proteínas modifica la composición de ácidos grasos y solamente N61, que no tiene acción termoprotectora, altera el estado físico-químico de la membrana. En estudios de expresión de novo en E.coli se observa que, a diferencia de las demás proteínas heterólogas, N61 activa la expresión de la mayoría de Hsps de E.coli sugiriendo una posible relación entre el estado físico de la membrana i la activación de la respuesta al estrés. En resumen, en este trabajo hemos probado la capacidad protectora de QsHsp17.4-CI y aportamos nuevos resultados sobre la importancia de la región N-terminal i la región consensus II del dominio -cristalino en esta función. Por otro lado, se sugiere que QsHsp17.4-CI podria interaccionar con la membrana de E.coli y que la región N-terminal seria imprescindible para dicha interacción. Finalmente, hemos determinado que las proteínas que provocan variaciones en el estado de fluidez de la membrana pueden activar la respuesta de choque de calor por parte de la célula bacteriana.

Autor: BADIA MARTINEZ DANIEL.
Año: 2004.
Universidad: POLITÉCNICA DE CATALUÑA.
Centro de lectura: Aula B2 de l'ETSEIB.
Centro de realización: ETSEIB, EDIFICI H PLANTA 4 Campus SUD.

Autor: MARTIN ENCABO SUSANA.
Año: 2004.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DEL CANCER.

Resumen: Mi trabajo se ha basado en caracterizar el efecto supresor de C3G sobre la transformación inducida por el oncogén Hras. La proteína C3G es un intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF) de Rap1 y R-Ras que posee dominios funcionales homólogos a otros GEFs de la familia Ras, como son los dominios CDC25 (o región catalítica), REM y el dominio rico en prolinas SH3-b (o de unión a Crk) (Tanaka et al., 1994). A pesar de que Rap1 es un antagonista de la transformación inducida por K-Ras (Sakoda et al., 1992), C3G es capaz de reducir el número de focos inducido por Hras, c-Sis, v-raf en células NIH 3T3 independientemente de la activación de Rap1(Guerrero et al., 1998). Hemos identificado que la función supresor de C3G está asociado al dominio SH3-b y suprime la transformación inducida por varios oncogenes como, Dbl y R-ras pertenecientes a varias rutas de señalización lo que determina su efecto generalizado. En concreto, el mecanismo de supresión ejercido por C3G sobre la transformación inducida por Ras se basa en reducir los niveles de ERK fosforilado, posiblemente a través de la activación de fosfatasas asociadas, ya que no modifica el estado de activación de los demás miembros que están por encima de ERK de la ruta de Ras-ERK. También la sobreexpresión de C3G reduce los niveles de expresión de ciclina A, lo que posiblemente resulta en una disminución de los niveles de Rb fosforilado y una menor capacidad de crecimiento independiente de anclaje al sustrato. Además la sobreexpresión de C3G también inhibe la ruta de PI3K-Akt, pero este efecto no está relacionado con la actividad supresora sobre la transformación de Ras. C3G se localiza en el Golgi y en la región subcortical del citoesqueleto de actina, siendo en esta última región subcelular dónde posiblemente C3G ejerce su efecto supresor sobre la transformación oncogénica, quizás a través de su interacción con la actina. Los niveles de C3G presentes en la célula determinan patrones de expresión de grupos de genes relacionados con la síntesis de matriz extracelular (Adamts5, Lama4, Msln, Ltpb1) y la regulación del ciclo celular (Rbp1, Nmyc, Trib1).

Autor: SANZ VICENTE MARIA.
Año: 2004.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA Y GENTICA.

Resumen: La pared celular fúngica constituye el exoesqueleto de hongos y levaduras, determinando su morfología y participando en numerosos procesos celulares. Al ser exclusiva de hongos y esencial para su supervivencia, representa una excelente diana para el diseño de antifúngicos con toxicidad selectiva. La quitina es un polímero minoritario de la pared pero constituye un elemento estructural esencial para la supervivencia fúngica. Su síntesis es llevada a cabo por las actividades Quitín Sintasas (QS). Este trabajo está centrado en el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la regulación de la actividad QSIII en la levadura Saccharomyces cerevisiae y en el hongo patógeno Candida albicans. Hemos demostrado que en S. cerevisiae la proteína Bni4p es necesaria para la localización temprana del complejo QSIII en el cuello asegurando el correcto ensamblaje del anillo de quitina, aunque también desarrolla funciones adicionales relacionadas con el ensamblaje del septo celular. La proteína Shc1p se ha identificado como un activador de la QSIII específico de esporulación, siendo imprescindible para la correcta maduración de las ascosporas a través de su participación en la síntesis de la capa de quitosán. Es por tanto funcionalmente redundante con Chs4p, el activador/localizador de la QSIII durante el crecimiento vegetativo. Ambos están diferencialmente regulados por una combinación de mecanismos transcripcionales y postraduccionales que permiten que no coincidan temporalmente en la célula. C. albicans posee un homólogo funcional de Chs7p, regulador clave de la actividad QSIII. Esto implica una conservación funcional en la regulación de la QSIII. El estudio de este gen ha demostrado que en C. albicans la quitina QSIII-dependiente no es requerida para el crecimiento ni la miceliación, pero desempeña un papel esencial en el mantenimiento de la integridad de la pared celular. Esta integridad es necesaria para el correcto crecimiento en sustratos sólidos y para la virulencia en modelos murinos.

Autor: PRIETO SANCHEZ ROSARIO MARIA.
Año: 2004.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER.

Resumen: La familia de GTPasas Rho/Rac participa en la generación de respuestas intracelulares coordinadas tras estímulos extracelulares. Esta familia participa principalmente en la regulación de la polimerización del citoesqueleto de actina, pero también en otros procesos celulares como la expresión génica, la supervivencia celular y las rutas de endocitosis. Este trabajo se ha centrado en la caracterización tanto estructural como funcional de un nuevo miembro de esta familia, la GTPasa RhoG, en procesos de señalización celular. En primer lugar, hemos demostrado que, a pesar de la elevada similitud estructural de RhoG con la GTPasa Rac1, la señalización mediada por cada una de estas proteínas se transmite a través de rutas funcionalmente independientes que, sin embargo, poseen elementos comunes. Hemos mostrado también que el comportamiento diferencial de ambas GTPasas en las funciones celulares estudiadas (activación de PAK1, capacidad transformante y localización subcelular) es controlado por regiones específicas de las GTPasas y, lo que es más, por aminoácidos específicos dentro de estas regiones. Sorprendentemente, estos residuos están situados fuera del SwitchI y del SwitchII, regiones que se han relacionado tradicionalmente con la interacción de las GTPasas Rho/Rac con sus proteínas efectoras. En segundo lugar, hemos demostrado que RhoG participa en la ruta endocítica mediada por caveolas. Así, RhoG se transloca inicialmente a la membrana plasmática, seguidamente a vesículas intracelulares y por último al aparato de Golgi tras el tratamiento de las células con activadores de la ruta caveolar (como la CTxB). Esta translocación está relacionada con cambios en el estado de activación de la GTPasa y depende tanto de la integridad de las balsas lipídicas de la membrana celular como de la funcionalidad de la dinamina. La activación constitutiva de RhoG (pero no de Rac1) promueve la internalización de las caveolas de la membrana y bloquea su tráfico posterior al aparato de Golgi. Además, la función reguladora de RhoG sobre la endocitosis caveolar es específica de esta GTPasa. Por otro lado, la generación de mutaciones en el dominio efector de RhoG produce cambios radicales en la estructura de las vesículas endocíticas, lo que indica que su integridad depende de la activación de efectores específicos. En cualquier caso, la expresión de un ARN interferente para RhoG demuestra que esta GTPasa no es esencial para la integridad de la ruta de endocitosis mediada por caveolas.

Autor: VEGA MORENO FRANCISCO MANUEL.
Año: 2004.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER.

Resumen: VRK1 es el miembro prototipo de la familia de quinasas de serina-treonina humanas VRK (Vaccinia-related kinases), con homología a la quinasa del virus vaccinia B1R, esencial para la replicación del ADN viral. VRK1 es una proteína nuclear que fosforila a diversos factores de transcripción in vitro como el supresor de tumores p53. En el presente trabajo abordamos la caracterización funcional de VRK1, la relación entre el supresor de tumores p53 y VRK1 e investigamos las funciones fisiológicas de VRK1 en la célula, así como su posible papel en procesos tumorales. VRK1 es una quinasa ampliamente expresada en distintas líneas celulares tanto tumorales como normales y durante todo el ciclo celular. Mediante experimentos de cotransfección mostramos que VRK1 induce la acumulación nuclear y actividad transcripcional de p53. Esta estabilización es debida a un efecto postraduccional sobre p53 y dependiente de la actividad quinasa de VRK1 aunque independiente de la acción de la quinasa de "checkpoint" Chk2. VRK1 fosforila in Vitro a p53 en la treonina-18 dentro de la región de unión a Mdm2 y la única fosforilación de p53 por la quinasa interrumpe la interacción entre estas dos proteínas in Vitro. VRK1 nos fosforila a Mdm2. In vivo el efecto de VRJ1 sobre p53 es, al menos parcialmente, independiente de Mdm2. La sobreexpresión de VRK1 promueve la fosforilación en treonina-18 de p53 y su acetilación por parte del coactivador p300, lo que podría explicar el aumento de la actividad transcripcional. La supresión de la expresión de VRK1 en líneas humanas provoca un fenotipo de disminución de la proliferación. La proteína VRK1 es encontrada en diferentes niveles en tumores, y altos niveles de la quinasa correlacionan con altos niveles de p53 y genes de respuesta a p53 en algunos tumores, así como con algunos marcadores típicos de proliferación. La familia VRK también está regulada durante el desarrollo hematopoyético murino. En conclusión, mostramos que VRK1 es una proteína implicada en proliferación cuya función podría estar desregulada en tumores humanos y que podría jugar un papel en la regulación del supresor de tumores p53.

Autor: SABIO BUZO GUADALUPE.
Año: 2004.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: CACERES.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIO.

Autor: POVEDA GABALDÓN ANA MARÍA.
Año: 2005.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIBLIOTECA DEL CAMPUS DE BURJASSOT.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: En las células eucariotas el DNA se encuentra asociado a diferentes tipos de proteínas, empaquetándose en una estructura organizada, denominada cromatina. La unidad básica de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en 147 pb de DNA ensamblados alrededor de un octámero de histonas, formado por dos copias de cada una de las histonas, H2A, H2B, H3 Y H4, Cada histona contiene dos motivos funcionales, el motivo histone fold que participa en interacciones histona-histona y también en interacciones histona-DNA, y las colas de los extremos NH2-terminal, que es susceptible de sufrir modificaciones postraduccionales, tales como acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación y sumoilación. Estas colas también participan en la interacción con nucleosomas adyacentes. Además de las histonas internas, la cromatina de eucariotas también contiene la histona H1, que se dispone en el exterior del nucleosoma, y otras proteínas no histona como las HMGs (High Mobility Group). La acetilación de histonas es una de las modificaciones postraduccionales que más se ha estudiado. Esta modificación es realizada por complejos hlstona acetiltransferasa (HA Ts), y es revertida por complejos histona desacetilasa (HDs). En base a la localización subcelular, la preferencia de histona y la habilidad de modificar histonas nucleosomales, los complejos HA T nativos se han clasificado en dos grupos. Los enzimas HAT tipo A son enzimas nucleares capaces de acetilar hlstonas ensambladas en cromatina, y que frecuentemente se asocian con procesos de regulación de la transcripción. Los enzimas HA T tipo B tienen una localización principalmente citoplasmática y únicamente acetilan histonas libres, presumiblemente antes de su deposición en el DNA para formar nucleosomas. En levadura se describió la presencia de una HAT tipo B, [Ruiz-García et al., 1998], que se aisló en la fracción citoplásmlca y que tenia una masa molecular de 200 kDa. Este enzima acetila especificamente la histona H4 libres, pero es incapaz de acetilar nucleosomas, y está formado, al menos, por la subunidad catalítica Hat1p y por Hat2p [Lopez-Rodas et al. ,1991, Kleff et al., 1995 Y Parthun et al, 1996]. En este trabajo se ha identificado bioquímicamente la proteína Hif1 (43,3 kDa, 385 aminoácldos), como una subunidad del enzima B, no Identificada hasta el momento. Además se han realizado estudios de localización subcelular, mostrando que las proteinas del complejo HAT-B se encuentran mayoritariamente en el núcleo. Asimismo, encontramos una dependencia de la localización subcelular de Hat1p con la presencia de Hat2p. En este trabajo mostramos que el complejo HA T-B acetila una fracción soluble de H4, no ensamblada en cromatina, en las lisinas 12 y 5. Cuando esta fracción soluble de H4 se acumula por alguna causa, es degradada por una ruta dependiente de la proteína Rad53, una proteína quinasa de checkpoint. La acetilación de la histona H4 es dependiente de las proteínas Hat1 y Hat2, pero no de la subunidad Hif1p, que no parece estar implicada en la función de acetilación. Además, tanto la proteína Hat1 como Hat2 son necesarias para la unión del sustrato, H4, pero Hif1p no participa en esta unión.