BIOLOGIA MOLECULAR, 4

Autor: LAGO FEMIA EVA DE.
Año: 2005.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (DPTO. BIOQUÍMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR III).

Resumen: Uno de los focos de mayor interés en el estudio del sistema cannabionoide como sistema comunicación intercelular, ha sido el proceso de terminación de la señal biológica mediada por este sistema. Esto ha sido debido principalmente a las grandes expectativas terapéuticas que podrían proporcionar los inhibidores de este proceso, que actuarían potenciando la acción de los endocannabionoides sobre sus receptores. El principal objetivo de la presente tesis doctoral ha sido la caracterización y evaluación bioquímica, farmacológica y terapéutica del inhibidor de la recaptación de endocannabinoides UCM707. Con este tipo de compuestos es posible minimizar los efectos indeseados asociados a la activación directa de los receptores CB1 por los agonistas clásicos cannabionoides, ya que, los niveles de endocannabionoides se mantendrían dentro de un rango de valores que eliminaría los efectos psicoactivos. Los resultados obtenidos indican que el UCM707 continúa siendo el inhibidor de la recaptación más potente y selectivo hasta la fecha, y se corresponde con la elevada potencia observada en ensayos in vivo, al intensificar los efectos producidos por una dosis subefectiva de anandamida. También se ha estudiado la capacidad del compuesto para modular los niveles de endocannabionoides y de neurotransmisores en el cerebro. Hemos analizado la utilidad del UCM707 en diversos modelos de enfermedades neurodegenerativas. UCM707 no ejerce neuroprotección en modelos de las enfermedades de Parkinson y de Huntington. Sin embargo, tiene importantes beneficios terapéuticos al mejorar las disfunciones motoras típicas de las etapas tempranas de la enfermedad de Huntington. En la esclerosis múltiple, UCM707 no disminuye la progresión de la enfermedad pero tiene un importante efecto antiespástico en modelso animales de la enfermedad. Hemos analizado también como este compuesto es capaz de modular la respuesta nociceptiva y de disminuir la respuesta dolorosa en un modelo de dolor neuropático. Por último, hemos llevado a cabo estudios para analizar posibles efectos reforzantes y/o tóxicos de este compuesto que en caso de producirse, reducirían su posible aplicación terapéutica, pero hemos encontrado que el UCM707 podría ser un compuesto bastante seguro. De todo este estudio, podemos concluir que este inhibidor puede ser un fármaco útil para el tratamiento de patologías como la esclerosis múltiple, la enfermedad de Huntington o el dolor neuropático, enfermedades para las que aún no se dispone de buenas herramientas farmacológicas.

Autor: WENCELAO MEZA NÉSTOR.
Año: 2005.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La deficiencia en Piruvato Kinasa Eritrocitaria humana (hRPK), un desorden autosómico recesivo producido por mutaciones en el gen PKLR, es una de las causas más comunes de anemia hemolítica crónica no esferocítica. La expresión transgénica de la RPK en precursores eritropoyéticos deficientes puede resultar una terapia alternativa en aquellos pacientes con síntomas severos. En este trabajo hemos construido vectores retrovirales que expresan el cDNA de la hRPK y la eGFP en un único RNA mensajero, separados por un IRES eucriótico (SF11RPXEG). Líneas celulares murinas 3T3 y MEL (Células de eritroleucemia murina ) y humanas HeLA y 293T fueron transducidas con sobrenadantes retrovirales infectivos. Análisis de western-blot y de FACS demostraron la expresión estable de EGFP y hRPK, respectivamente, con expresión estable del transgén durante más de 20 semanas en cultivo. La expresión de los trasngenes no varió significativamente durante el tiempo del cultivo. Además, la inducción a eritrodiferenciación de células MEL no modificó la expresión de hRPK ni de eGFP. Posteriormente, progenitores hematopoyéticos Lin-Sca-1+ fueron transducidos in vitro con SF11RPKXEG y transplantado s en receptores normales letalmente irradiados. Tres meses post-transplante, una elevada expresión de hRPK y eGFP fue observada en leucocitos, plaquetas y eritrocitos maduros. Estos resultados indican que los vectores retrovirales pueden ser una sistema efectivo para abordar la corrección fenotípica de los defectos eritropoyéticos asociados a la deficiencia de Piruvato Kinasa Eritrocitaria humana mediante de protocolos de terapia génica.

Autor: BAUTISTA AVILA MIRANDELI.
Año: 2005.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA, INSTITUTO DE BIOQUÍMICA CSIC/UCM.

Resumen: En el presente trabajo se somete a estudio la respuesta del hígado frente a un agente de hepatotoxicidad conocida, como es la tioacetamida, cuando dicho hígado ha sido pretratado con un agente inhibidor de la función de las células de Kupffer (macrófagos residentes en el hígado), como es el cloruro de gadolinio. Esto nos ha permitido contemplar las modificaciones en los parámetros de lesión hepática y regeneración al igual que las variaciones que se producen en los mismos como consecuencia de la interacción entre ambos compuestos. Los resultados presentados demuestran que el agente hepatotóxico tioacetamida potencia la actividad de las células de Kuppfer, lo que se refleja en un incremento en el grado de necrosis hepatocelular y estrés oxidativo y en un incremento en la expresión de las proteínas del estrés: metalotioneína y HSP70. Se encontró también que la tioacetamida induce la expresión y liberación de TNFalfa e IL-6, así como la actividad de la mieloperoxidasa en suero. Estas citoquinas y la actividad de la mieloperoxidasa son principalmente producidas por las células de Kupffer y se encuentran involucradas en la programación de daño hepático producto de la respuesta inflamatoria. El bloqueo de la función de las células de Kupffer por el cloruro de gadolinio interrumpe al parecer algún paso de la secuencia de eventos que conducen a la hepatoxicidad. Entre otras cosas se concluye que la modulación de la función y actividad de las células de Kupffer, puede servir como blanco terapéutico potencial siendo útil para prevenir el daño hepático inducido por fármacos.

Autor: FERNÁNDEZ SAN MILLÁN ALICIA.
Año: 2005.
Universidad: PÚBLICA DE NAVARRA.
Centro de lectura: INSTITUTO DE AGROBIOTECTNOLOGÍA Y RECURSOS NATURALES.
Centro de realización: INSTITUTO DE AGROBIOTECNOLOGÍA Y RECURSOS NATURALES.

Resumen: La albúmina humana (HSA) es la proteína intravenosa más utilizada en el mundo con fines terapéuticos. El consumo anual en España es de 10.000 Kg, pero su demanda excede a las 500 toneladas a nivel mundial, representando un valor de mercado de más de 1.500 millones de euros. Todavía no se ha desarrollado un sistema económicamente rentable que pueda competir con el actual método de extracción a partir de sangre, por lo que nos propusimos estudiar la posibilidad de producir HSA en plantas transgénica. Existen precedentes en los que se ha producido HSA en diversas especies vegetales mediante transformación nuclear, aunque los niveles de expresión siempre han sido bajos (menos del 1% de la proteína soluble total) e insuficientes para ser rentables. La transformación plastidial presenta ventajas importantes, entre las que destacan los altos niveles de expresión de las proteínas recombinantes. En consecuencia, el presente proyecto tiene como objetivo la optimización dela producción de albúmina humana en cloroplastos transgénicos de tabaco. Se diseñaron varios vectores para elegir aquel que optimizar la expresión de HSA en cloroplastos. Entre varias construcciones diseñadas, los mejores resultados se han obtenido cuando la HSA se expresa en presencia del promotor y la región 5' no traducía del gen psbA. La producción de HSA en las plantas de la línea más productiva varía a lo largo de su ciclo vital entre 1,2-10,5% de la proteína total extraída y 0,02-0,95 mg/g eso fresco de hoja, demostrándose que el momento de cosecha puede influir decisivamente en el rendimiento final. También se ha observado que la HSA recombinante se acumula en el estroma de los clorplastos en cuerpos de inclusión, que pueden ser solubilizados pro completo para dar lugar a la HSA en forma monomérica. Por otra parte, se ha abordado el reto de producir HSA con una secuencia amonoacídica idéntica a la humana. Puesto que la HSA es una prepro-proteína, la secuencia madura carece del ATG de inicio de la traducción, por lo que en la primera fase del estudio, dicho triplete fue añadido en el extremo amino de la HSA. De esta forma, los cloroplastos producían una HSA con una metionina adicional en su extremo amino. Aunque esta albúmina puede ser funcional, ciertas propiedades que residen en la conformación del extremo amino podrían verse alteradas. Por ello, se ha estudiado un estrategia para expresar la HSA madura fusionada al péptido sirve como inicio de la traducción y posteriormente se procesa en el estroma correctamente para liberar la albúmina madura idéntica a la humana. Por último, las líneas transgénicas obtenidas han sido caracterizadas a nivel molecular y productivo. Se ha estudiado la estabilidad de la HSA in vivo y tras diferentes condiciones de almacenaje en postcosecha, con el fin de determinar el momento de recolección y sistema de procesado más adecuado.

Autor: GIMÉNEZ-CASSINA SENDÓN ALFREDO.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS, DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La disfunción mitocondrial es típica de la mayor parte de las enfermedades neurodegenerativas, y se considera que contribuye en gran medida a la degeneración neuronal. En este trabajo hemos tratado de contrarrestar la disfunción mitocondrial mediante estrategias de transferencia génica con vectores de HSV-1, con el objetivo de paliar la neurodegeneración. En primer lugar, hemos establecido modelos experimentales de células neuronales para llevar a cabo estudios de neurodegeneración y neuroprotección. Sí, hemos empleado el agente neurotóxico rotenona para inducir disfunción mitocondrial a través de la inhibición del complejo I mitocondrial, constituyendo un modelo experimental interesante para evaluar la influencia de la disfunción mitocondrial en la neurodegeneración. En segundo lugar hemos estudiado el efecto de modular la actividad de la enzima glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) sobre la toxicidad inducida por rotenona, ya que la GSK-3 es una quinasa implicada en la modulación de distintos procesos celulares, incluyendo la apoptosis. Demostramos que la inhibición crónica de la GSK-3, bien mediante la expresión de un mutante dominante negativo de GSK-3 (85R), bien mediante el empleo de inhibidores farmacológicos, tiene un efecto neuroprotector frente a la rotenona en células similares a neuronas humanas en cultivo y en neuronas primarias de bulbo raquídeo de ratón. Hemos evaluado distintos mecanismos moleculares posibles que expliquen este efecto neuroprotector. Mostramos que la inhibición crónica de GSK-3 resulta en un incremento en el consumo de glucosa por la vía glucolítica. Además, hemos observado también que la neuroprotección inducida por inhibición crónica de GASK-3, la hexoquinasa II (HKII) se localiza preferentemente en la mitocondrial mientras que el transportador de glucosa GLUT3 se transloca a la membrana plasmática. Así, la inhibición crónica de GASK-3 podría estar protegido a las neuronas frente a al muerte celular inducida por disfunción mitocondrial mediante cambios en el perfil metabólico que incluyen un incremento en la tasa glucolítica que podría estar compensando el déficit bioenergético inducido por la rotenona. Además, la translocación de HKII a la mitocondria podría también tener un papel antiapoptótico, modulando la permeabilidad de la membrana mitocondrial. Además, nuestros resultados también demuestran que la inhibición crónica de la GASK-3 podría resultar en un significativo incremento en la secreción al medio extracelular de factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF); el bloqueo en la señalización del BDNF a través de su receptor neutralizó parcialmente el efecto neuroprotector frente a la rotenona inducido por inhibición crónica de GSK-3. Además, hemos desarrollado otra estrategia de neuroprotección frente a la muerte neuronal inducida por protenona expresando frataxina, una proteína mitocondrial implicada en la regulación del metabolismo del hierro y la fosforilación oxidativa, entre otras funciones. Hemos diseñado y generado vectores de HSV-1 que codifican el locus genómico completo de la frataxina humana y hemos evaluado su expresión en distintos tipos celulares. También hemos analizado el efecto de la expresión de la frataxina humana sobre la toxicidad inducida por rotenona, demostrando que la expresión de la frataxina humana tiene un efecto neuroprotector frente a la muerte celular inducida por disfunción mitocondrial. Finalmente, hemos diseñado y generado vectores virales que puedan reportar cambios en la actividad del promotor de la frataxina en función de las condiciones o a lo largo del tiempo. Mostramos así que el tratamiento con eritropoyetina incrementa significativamente a la actividad del promotor de la frataxina en células similares a neuronas humanas en cultivo. En conjunto, este trabajo demuestra la posibilidad de llevar a cabo eficientemente transferencia génica a células neuronales con el fin de desarrollar estrategias de neuroprotección frente a la muerte celular inducida por la disfunción mitocondrial.

Autor: SÁNCHEZ DE ABAJO ANA.
Año: 2005.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: HOSPITAL CLÍNICO SAN CARLOS.

Resumen: El objetivo principal de la tesis ha sido la caracterización molecular de las familias HNPCC españolas. Para ello, se ha hecho un estudio de inestabilidad a microsatélites y de expresión por inmunohistoquímica de las proteínas hMLH1, hMSH2, hMSH6 y hPMS2 en los tumores de los probandos de las familias seleccionadas pro criterios clínicos. Con este estudio se han podido establecer dos grupos de familias, las que tenían alta inestabilidad en las cuales se estudiaron los genes reparadores implicados en la susceptibilidad al cáncer y las de baja inestabilidad en las cuales se estudiaron otros genes de bajo riesgo implicados en el cáncer colorrectal. De esta forma se ha caracterizado un subgrupo de familias HNPCC sin defectos en el sistema MMR. En las familias con alteraciones en los genes MMR, se ha diseñado un algoritmo de estudio que va permitir optimizar el proceso del análisis genético en familias HNPCC.

Autor: FERNÁNDEZ ALONSO JUAN MANUEL.
Año: 2005.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Este trabajo intenta profundizar en los conocimientos que actualmente poseemos sobre el cáncer de mama de tipo familiar. Concretamente, aborda el tema desde tres aspectos distintos que, al final, quedan integrados en la discusión. En primer lugar, se trata de desarrollar una estrategia de análisis genético eficaz en familias españolas afectas de cáncer de mama, estableciendo un algoritmo de optimización del test genético paralos genes BARCA1 y BRCA2 según criterios beneficio/coste o beneficio/tiempo. En segundo lugar, el desarrollo de un modelo empírico de predicción del riesgo pre-test de portar mutación germinal en los genes BARCA1 o BRCA2. Para ello, el estudio propone una serie de parámetros clínicos que se asociaron a susceptibilidad a cáncer de mama en familias mama/ovario españolas. Y, en tercer lugar, el estudio profundiza en el carácter poligéncio de la enfermedad estudiando cuatro candidatos a genes de susceptibilidad en cáncer de mama (BARD1, CXorf53, BRE y TFGbeta-R1) y su relación biológica con BRCA1.

Autor: FERNÁNDEZ MARTÍNEZ AMALIA.
Año: 2005.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Esta memoria se centra en el estudio de la relación entre la expresión de COX-2 y la patología hepática, ya que existen numerosos proceso fisiopatológicos relacionados con la sobre-expresión de COX-2 y cada vez se descubren más. Para ello hemos empleado dos abordajes, analizando modelos preexistentes de patología hepática -regeneración tras hepatectomía parcial, tratamiento agudo con tioacetamida y biopsias hepáticas humanas con enfermedad crónica inducida por el virus de la hepatitis C además, de modelos celulares in vitro-, y trabajando con modelos de sobre-expresión de COX-2, con aproximaciones experimentales tanto in vitro como in vivo, para el estudio de la relación entre las prostaglandinas producidas por COX-2 y el proceso de apoptosis, uno de los mecanismos propuestos para la implicación de XOX-2 y sus prostaglandinas en la progresión tumoral. De estos modelos se deduce que las prostaglandinas producidas a partir de la acción de COX-2 contribuyen de manera importante en el inicio y desarrollo de varios proceso fisiopatológicos que cursan con un incremento de la proliferación celular en el tejido hepático.

Autor: CAÑAS PENDÓN RAFAEL ANTONIO.
Año: 2005.
Universidad: MÁLAGA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.

Resumen: Las reservas nitrogenadas de las semillas del pino están compuestas por proteínas con un alto contenido en arginina. La utilización del nitrógeno contenido en estas reservas es especial para la germinación y el desarrollo de la planta. Durante la germinación las proteínas son hidrolizadas liberando la arginina que se transporta a la planta en desarrollo donde se hidroliza por la actividad arginasa produciendo ornitina y urea. Hasta el momento se desconocía el destino metabólico de la ornitina pero en este trabajo se propone que es empleada por la enzima orinita *-aminotransferasa (PsdOAT) para la síntesis de glutamato, postulándose como la principal fuente de glutamato durante la germinación y en las etapas tempranas del desarrollo plantular. Por otra parte, durante estas etapas se ha observado una gran acumulación del aminoácido asparragina. En la tesis se postula que la asparragina es sintetizadas por una asparragina sintetasa (PsAS1) a partir del nitrógeno del catabolismo de la arginina. Finalmente, se propone que un gen que codifica una asparraginasa (PsASPG) emplea la asparragina acumulada en el hipocótilo de las plantas para el desarrollo del sistema vascular.

Autor: CIFUENTES BUIRA DANIEL.
Año: 2005.
Universidad: BARCELONA.

Resumen: En la red metabólica molecular, miles de sustratos están interconectados mediante reacciones bioquímicas. A pesar que este alto grado de conexión podría desembocar en el flujo de sustratos en múltiples direcciones, a la práctica los flujos metabólicos se canalizan a través de vías metabólicas específicas. Un punto clave para la comprensión dela organización celular y la homeostasis del organismo es entender cómo se definen estos módulos funcionales y se aíslan unos de otros para asegurar el correcto funcionamiento del organismo. Para responder esta cuestión utilizamos el metabolismo del glucógeno como modelo de estudio, en particular la relación que se establece entre las glucógeno sintasas (GS) y las hexoquinasas (HK1 i GK), a través de la glucosa-6-fosfato (G6P). Con la sobreexpresión de la HK1 y la GK mediante adenovirus recombinantes demostramos que la GK induce mejor que la HK1 la activación de la GS hepática mediada por G6P porque la GK sintetiza más eficientemente las elevadas concentraciones de G6P que requiere la activación de la GS hepática. Mediante el análisis de las fiogenias y del patrón de expresión de los isoenzimas implicados en el metabolismo del glucógeno, de las hexoquinasas, glucógeno sintasas y transportadores de glucosa (GLUT), indica que la aparición de isoformas específicas de tejido en el origen de los vertebrados mediante duplicación génica, contribuye a la creación de módulos metabólicos independientes. La visión global que nos proporcionan los estudios evolutivos junto con los datos bioquímicos previos, confirma que los dos tándems de isoenzimas, GLUT2/GK/GS hepática y GLUT4/HK/GS muscular, co-evolucionan para adaptarse a las necesidades metabólicas características del tejido en el cual se expresan.

Autor: GUIJARRO LARRAZ PATRICIA.
Año: 2005.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Los factores guía son proteínas esenciales en el proceso de guía de neuronas y axones que ocurre durante el desarrollo del sistema nervioso. Netrinas y Semaforinas y componen dos de las cinco familias de factores guía existentes. En este trabajo, nosotros hemos estudiado el efecto quimiotáctico de Netrina1 y Semaforinas secretables Sema3A y SEma3F en la guía de interneuronas y sus axones durante el desarrollo del cerebelo y el hipocampo, así como la participación de Sema3A en el proceso de regeneración de axones axotomizados en un modelo in vitro. El primer objetivo de nuestro trabajo fue el estudio de la función de Netrina1 en el desarrollo postnatal de interneuronas de la corteza cerebelar, y pudimos constatar que: A,- Netrina1 es un factor quimiorepulsivo in vitro para interneuronas de la corteza cerebelar postnatal. B,- Netrina1 y sus receptores Dcc, Unc5h2 y Unc5h3 se expresan en la corteza cerebelar durante el desarrollo postnatal. C,- Las interneuronas de la corteza postnatal cerebelar expresan NEtrina1 y sus receptores Dcc, Unc5h2 y Unc5h3. D,- Dcc no parece participar en la señal quimiorepulsiva de Netrina1 ante interneuronas de la corteza cerebelar. E,- Las interneuronas de la corteza cerebelar migran tanto in vitro como in vivo a asociadas a fibras gliales. Nuestro segundo objetivo fue estudiar el efecto de Sema3A y Sema3F sobre axones GABAérgicos de la formación hipocampal en desarrollo. Hemos observado que: A,- Sema3A y Sema3F son agentes quimiorepulsivos in vitro sobre axones hipocampales embironarios y posnatales, mientras que solamente Sema3F repele axones entorrinales embrionarios. B,- Sema3A, Sema3F y sus respectivos receptores Neuropilina1 y Neuropilina2 se expresan en el hipocampo a edades embrionarias y postnatales. C,- interneuronas GABAérgicas de la capa piramidal y el estrato oriens expresan Neuropilina1 y 2 , mientras que aquellas situadas en los estratos radiado y lacunosum-moleculares no expresan dichos receptores. Nuestro tercer y último objetivo fue estudiar el posible efecto inhibitorio de Sema3A sobre axones adultos axotomizados, utilizando el cultivo organotípico entorrino-hipocampla como modelo de lesión in vitro. Nosotros demostramos que: 1,- Tras axotomía a 15 días in vitro (DIV)m, cuando los axones entorrionales no regeneran, aumenta la expresión de Sema3A tanto en hipocampo como en corteza entorrinal, y también aumenta la expresión de su receptor Neuropilina1 en corteza entorrinal. 2,- En cultivos organotípicos entorirno-hipocampales obtenidos de ratones homocigotos deficientes en Sema3A, se produce la regeneración parcial de axones entorrinales axotomizados a 15DIV.

Autor: BORRAZ ORDÁS CARMEN.
Año: 2005.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA/H.U.BELLVITGE.

Resumen: Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) es un patógeno de gran importancia para la salud Pública tanto a nivel hospitalario como en la comunidad. Presenta una rápida diseminación por todo el mundo y crea resistencias a los diferentes antibióticos con gran facilidad. En España se describió por primera vez a finales de 1970 y su frecuencia hasta nuestros días ha seguido un curso ascendente en el que se ha producido cambios epidemiológicos y moleculares destacables. Con objeto de conocer la situación actual del SARM en España, se realizó un estudio multicéntrico durante el período de junio de 2003 en el que participaron 64 hospitales españoles pertenecientes a 14 Comunidades Autónomas. Se determinó el porcentaje de resistencia a meticilina en las cepas aisladas durante dicho período, se estudió la sensibilidad a otros antibióticos no beta-lactámicos, así como las propiedades genotípicas de las cepas SARM, la detección de genes de resistencia a macrólidos y finalmente al estudio de la producción de leucocidina de Panton-Valentine en aquellas cepas de adquisición comunitaria y en una selección de cepas de origen nosocomial. La metodología empleada fue: caracterización bioquímica de microorganismos, técnicas microbiológicas convencionales, métodos moleculares de ácidos nucleicos como PCR, Electroforesis en campo pulsátil (ECP), multilocus sequence tuyping (MLST), staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). Detección de factores de virulencia. Los resultados obtenidos reflejaron las siguientes conclusiones: * El porcentaje de resistencia a meticilina fue del 20% (similar al obtenido en otros estudios realizados en nuestro país y en Europa). * No se detectaron cepas resistentes a glucopéptidos, aunque un 1,4% de las cepas presentaron heterorresistencia a vancomicina. * El 60% de las cepas resistentes a eirtromicina presentaron un fenotipo MLSB codificado por los genes ermA y ermC y el 40% restant presentaron un fenotipo MSB codificado por el gen msrA. * Se identificó un complejo clonal dominante, 73% de las cepas (ST, 125::P/Q::mecIV) cuyo ancestro genético podría estar relacionado con el clon epidémico internacional denominado Clon Pediátrico (ST5::mecIV). Estaba presente en todos los hospitales participantes en el estudio. * En menor frecuencia se detectaron otros clones epidémicos, EMRSA-16 (ST36::mecll), 8% aislado preferentemente en la comunidad Gallega, EMRSA-15 (ST22::mecIV), 2%, aislado en un hospital de Palma de Mallorca; y un solo aislamiento del Clon Ibérico (ST247::mecl) aislado en un hospital de Toledo. * La prevalencia de los aislamientos de SARM de origen comunitario, productores de leucocidina de Panton-Valentine fue baja (3%). Las tres cepas fueron aisladas en dos hospitales en Barcelona y pertenecieron al mismo clon (ST8::BG:: mecIV).

Autor: CARRILLO VICO ANTONIO.
Año: 2005.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La melatonina es un compuesto que se describió por primera vez en 1958 como una hormona sintetizada por la glándula pineal. Actualmente, se puede considerar como un compuesto pleiotrópico con importantes propiedades cronobióticos, antioxidantes, oncostáticas e inmunomodulares. Ejerce sus funciones a través de diversos mecanismos de acción, entre ellos, por medio de la unión a receptores de membrana y nucleares. En los últimos años, se ha puesto de manifiesto la presencia de este compuesto en un gran número de órganos, tejidos y células, lo cual ha puesto de manifiesto la posibilidad de fuentes extrapineales de melatonina, contribuyendo a redefinir la línea clásica de pensamiento acerca de la melatonina como una hormona exclusivamente pineal. En función de estos antecedentes, los objetivos planteados fueron los siguientes: 1,- Localizar e identificar sitios de unión para melatonina en células de timo y bazo de ratón. 2,- Detectar la expresión génica de los receptores para melatonina MT1, MT2 y RORalfa, así como la expresión de las proteínas MT1 y RORalfa1 en timo y bazo de ratón. 3,- Analizar el efecto de la melatonina a través de sus receptores de membrana sobre la inhibición de la producción de IL-2 inducida por la PGE2, en cultivos primarios de PBMCs humanas. 4,- Identificar síntesis activa de melatonina en cultivos primarios de PBMCs humanas. 5,- Analizar los efectos y los mecanismos de acción de la melatonina endógena sobre el sistema IL-2/IL-2R. Las conclusiones a las que llega el estudio tras evaluar los resultados fueron: 1,- Existen sitios de unión para melatonina en membrana plasmática y núcleo de células de timo y bazo de ratón. 2,- Los genes que codifican los receptores de melatonina MT1 y RORalfa se expresan en timo y bazo de ratón, mientras que la expresión de MT2 sólo se detecta en timo. 3,- Tanto el timo como el bazo de ratón presentna las proteínas MT1 y RORalfa1. 4,- La melatonina contrarresta los efectos inhibitorios de la PGE2 sobre la producción de IL-2 en cultivos primarios de hPBMCs a través de la unión a sus receptores de membrana. 5,- La acción neutralizada de la melatonina sobre la inhibición de la producción de IL-2 mediada por la PGE2 se lleva a cambio mediante un descenso en los niveles de AMPc estimulados por la PGE2. 6,- Las hPBMCs expresan el gen del receptor MT1, el cual media las acciones de la melatonina sobre los efectos de la PGE2. 7,- Las hPBMCs expresan los genes que codifican para las enzimas AA-NAT e HIOMT y presentan las actividades enzimáticas de dichas proteínas. 8,- Las hPBMCs cultivadas in vitro tienen la capacidad de sintetizar y liberar melatonina. 9,- La melatonina endógenamente sintetizada pro las hPBMCs actúa por medio de la unión a sus receptores de membrana y nucleares como un factor intra-, auto- y/o para-crino regulando el sistema IL-2/IL-2R.

Autor: ALONSO SARASQUETE Ma. EUGENIA.
Año: 2005.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: HOSPITAL UNIVERSITARIO DE SALAMANCA.

Resumen: El Mieloma múltiple (MM) es una enfermedad incurable en la que la mayoría de los pacientes recae por la persistencia de células tumorales que regeneran la enfermedad, concepto denominado enfermedad residual mínima (ERM). El análisis de la ERM ha demostrado su utilidad en la detección precoz de recaídas en otras neoplasias hematológicas, por ello tratamos de estandarizar una técnica para su seguimiento. Nuestro primer hallazgo se basa en el empleo de una nueva diana, el reordenamiento incompleto DJ de los genes de inmunoglobulinas, para su amplificación mediante PCR cuantitativa para el estudio de ERM. Esta diana tiene como principal ventaja estar presente hasta en el 60% de los pacientes con MM y además no está mutada, lo que permite la correcta hibridación de primers y sonda con la secuencia complementaria. Las técnicas estándar para seguimiento de ERM son la Citometría de Flujo (CMF) y la PCR cuantitativa en tiempo real (RQ-PCR). Su aplicación simultánea en el análisis de ERM de una serie de pacientes con MM en remisión completa (n=24) demostró que, a pesar de que la RQ-PCR resulta ligeramente más sensible y detecta ERM en mayor número de casos (17/24), la Citometría es más sencilla y aplicable a mayor número de casos (90% CMF vs. 75% RQ-PCR) resultando la técnica de elección para el seguimiento de ERM en MM. Ambas técnicas coinciden en que una reducción de la carga tumoral por debajo de 0.01% confiere un mejor pronostico. El análisis de la expresión génica de la célula tumoral constituye un marcador propio y es uno de los principales determinantes de la biología de las células. Por ello analizamos los niveles de expresión de una serie de genes supresores tumorales (p14, p15 y p16) en pacientes con MM sintomático (N=52) y con Mieloma quiescente (N=7) y encontramos una mayor expresión en los MM quiescentes respecto a los sintomáticos. Considerando sólo estos últimos, descubrimos una correlación estadísticamente significativa entre niveles elevados de expresión génica y factores clínico-biológicos de buen pronóstico, menor actividad proliferativa, mejor respuesta al tratamiento y mayor supervivencia global. Estos datos sugieren la correlación entre niveles elevados de expresión génica y formas menos agresivas de la enfermedad, similares al MM quiescente.

Autor: BLANCO BENAVENTE SANDRA.
Año: 2005.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER.

Resumen: VRK es una nueva familia de serina-treonina quinasas con función desconocida. VRK2 endógena se localiza en el núcleo y en el citosol, como consecuencia de la expresión de dos isoformas generadas mediante un procesamiento alternativo del mensajero de VRK2, que da lugar a proteínas de 508 y 397 aminoácidos. VRK2A contiene una región hidrofóbica que ancla la proteína a la membrana del retículo endoplasmático y mitocondrias y se expresa en la mayoría de tipos celulares estudiadas, mientras que VRK2B se localiza libre en el núcleo y en el citosol y se expresa en líneas celulares en las que VRK1 es citosólica. Ambas isoformas comparten un dominio catalítico idéntico y fosforilan p53 in vitro únicamente en treonina 18. Solamente la sobre-expresión de la isoforma nuclear VRK2B induce la estabilización de p53 mediante un mecanismo postraduccional, principalmente debido a la fosforilación en treonina 18, que induce la disminución de la ubiquitinación por Mdm2 y promueve la acetilación por p300. En este contexto, VRK2B podría reemplazar funcionalmente a la quinasa nuclear VRK1, formando parte de rutas de señalización implicadas en procesos proliferativos. La proteína de anclaje JIP1 ensambla complejos de señalización compuestos por MAPK quinasas. La actividad de éstos es modulada mediante interacciones con otras proteínas. VRK2 co-localiza con JIP1 en la región perinuclear, e interacciona de forma estable con el dominio C-terminal de JIP1. No obstante esta asociación no interfiere con la interacción entre JIP1 y TAK1, MKK7?1 o JNK. Sin embargo, VRK2 disminuye la activación de JNK detectada como una reducción en su fosforilación y la disminución de la activación de la trasncripción dependiente de AP1. De esta forma VRK2 modula la respuesta celular inducida por interleuquina-1? y DFO-hipoxia, mediada por la activación de TAK1, lo que sugiere que VRK2 puede alterar el balance de señales generadas por estos estímulos en la célula.

Autor: CABALLERO VELAZQUEZ ROSALIA.
Año: 2005.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: DEPARTAMENTO DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Autor: DE LOS RIOS ALFONSO LAURA.
Año: 2005.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA-BIOQUIMICA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO MICROBIOLOGIA Y GENETICA.

Resumen: La metilación del DNA es esencial para el desarrollo de los mamíferos y representa un elemento clave para el control de la información genética; este proceso tiene lugar en la posición 5' de la citosina, que se sitúa en el dinucleótido CpG. Las islas CpG son agrupaciones de estos dinucleótidos, de aproximadamente 1 kb, que se sitúan en la región promotora del 60% de los genes en humanos. Éstas se mantienen libres de metilación en condiciones fisiológicas, excepto las que se encuentran en el cromosoma X inactivo y en el alelo inactivo de los genes regulados por imprinting. Los genes sometidos a imprinting se caracterizan por presentar una expresión monoalélica dependiendo del origen parental. Estos genes se encuentran asociados a islas CpG y tienen funciones importantes en el desarrollo y el crecimiento fetal de los mamíferos. Sus mecanismos de inactivación monoalélica están mediados por modificaciones epigenéticas, como la metilación del DNA y las modificaciones histónicas. Estudios realizados para la identificación de cambios de expresión génica en fibroblastos embrionarios murinos (MEFs), cuando las células se encuentran bajo situación de estrés, pusieron de manifiesto que la acumulación de divisiones celulares en cultivos de MEFs provoca la inactivación transcripcional de genes sometidos a imprinting genético. Esta situación de estrés también causa la metilación de novo de las islas CpG que se sitúan en los alelos activos de estos genes. La metilación aberrante afecta exclusiva o preferentemente a los genes sometidos a imprinting, ya que no se detecta en islas CpG asociadas a genes situados en cromosomas autosómicos ni en las asociadas a genes del cromosoma X activo. Este fenómeno no tiene lugar únicamente en condiciones de cultivo, sino que afecta también a los mismos genes durante el desarrollo tumoral en ratones, in vivo. La sensibilidad de estos genes al estrés celular abre la posibilidad de su utilización como marcadores tumorales tempranos. La metilación de novo del promotor del gen regulado por imprinting -Cdkn1c- no ocurre cuando el alelo metilado no está presente, ni en ratones híbridos cuando se encuentra inhibido el proceso de recombinación en la región que contiene a dicho gen. Esto sugiere que el patrón de metilación podría transferirse del alelo inactivo al activo mediante un proceso de recombinación mitótica; éste generaría un intermediario hemimetilado que actuaría como sustrato de la DNA metiltransferasa de mantenimiento.

Autor: GONZALEZ HERRERO INES.
Año: 2005.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: INST.DE BIO. MOLE. Y CELU.DEL CANCER.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DEL CANCER.

Resumen: SLUG (SNAI2), es un factor de transcripción con dominios tipo dedos de zinc relacionado con SNAIL, esencial para el desarrollo normal de células derivadas de la cresta neural. Mutaciones SLUG de pérdida de función contribuyen al piebaldismo y al síndrome de Waardenburg de tipo 2 de forma dependiente de la dosis. Sin embargo, se conoce poco acerca de la sobreexpresión de SLUG en estado patológico y en desarrollo embrionario. Estudiamos una duplicación de SLUG en un niño con una única duplicación de novo 8q11.2?q13.3, asociada con tetralogía de Fallot, cierre del paladar submucoso, anomalías renales, hipotonía y retraso en el desarrollo. Para comprobar los efectos de la sobreexpresión de Slug en desarrollo y en cáncer, generamos ratones que poseen un transgen Slug reprimible mediante tetraciclina. Estos ratones eran morfológicamente normales al nacer, y desarrollaron tumores mesenquimatosos (leucemias y sarcomas) en la mayoría de los casos examinados. La supresión del transgen Slug no rescató el fenotipo maligno. Asimismo, el oncogén BCR-ABL, que induce la expresión de Slug en células leucémicas, no provocó leucemia en ratones deficientes en Slug, implicando a Slug en la leucemogenesis BCR-ABL in vivo. Además, en los ratones adultos, había un 20% de incidencia de muerte súbita, cardiomegalia y fallo cardiaco, asociado con una incipiente tumorogénesis mesenquimal. Los datos indican que mientras que la sobreexpresión de Slug no es suficiente para producir defectos morfogenéticos evidentes en ratones, puede contribuir directamente al fenotipo cardiaco y desarrollo de cáncer realizando un papel específico y esencial en la patogénesis de los tumores mesenquimatosos.

Autor: GONZALEZ NUÑEZ VERONICA.
Año: 2005.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En este trabajo se han estudiado algunos de los mecanismos bioquímicos responsables de la actividad de los agentes opiáceos, utilizando el pez cebra como modelo experimental. Primeramente hemos clonado y caracterizado la pronociceptina y prodinorfina de pez cebra, encontrando en estos precursores nuevas secuencias para péptidos opioides. Seguidamente hemos caracterizado farmacológicamente el péptido Met-encefalina-Gly-Tyr, demostrando que se une a receptores opioides de pez cebra y mamífero, pudiendo actuar como ligando endógeno de los receptores ZFOR1 y ZFOR4. Asimismo, la dinorfina A de pez cebra se une a todos los receptores opioides de pez cebra. El estudio de la internalización del receptor ZFOR4 ha demostrado que este receptor es internalizado por la etorfina y por péptidos endógenos, presentando diferencias en la dosis efectiva media, pero no en la cinética. El receptor ZFOR3 sólo es internalizado por la dinorfina A o por la dinorfina 1-13, con una cinética y dosis efectiva media parecidas a las encontradas para ZFOR4. Los estudios de la activación de las MAP kinasas han demostrado que los receptores ZFOR1 y ZFOR4 activan transitoriamente ERK1/2 tras la unión de etorfina y de péptidos endógenos, observándose la existencia de una actividad constitutiva de estos dos receptores. El receptor ZFOR3 activa las MAP kinasas tras la unión de agonistas y de antagonistas como la naloxona, siendo dicha activación más prolongada en el tiempo. Finalmente podemos señalar que a pesar de las diferencias estructurales, farmacológicas y funcionales entre el sistema opioide del pez cebra y el de mamífero, los procesos de unión y activación de los receptores opioides, así como la transducción de la señal, son semejantes entre estos dos grupos de organismos. Por ello, podemos establecer que el sistema opioide del pez cebra es un buen modelo para el estudio de los mecanismos que rigen la acción de los agentes opioides.

Autor: REYES MARTIN DAVID.
Año: 2005.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: EDIFICIO HISTORICO.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.