BIOLOGIA MOLECULAR, 5

Autor: ARIZ LÓPEZ DE CASTRO USUE.
Año: 2005.
Universidad: PAÍS VASCO.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: PROGENIKA BIOPHARMA S.A. Y DEPARTAMENTO NEUROCIENCIAS (UPV).

Resumen: La esclerosis múltiple es una enfermedad inflamatoria desmielinizante del SNC y el trastorno neurológico más común en adultos jóvenes. Para un mayor entendimiento de los procesos implicados en el desarrollo de enfermedades desmielinizantes como ésta, es importante la utilización de modelos experimentales en los que se pueda provocar el proceso de desmielinizaicón y que permitan la obtención de nuevas dianas moleculares de interés. El modelo utilizado en este trabajo consistió en el aislamiento y cultivo de oligodendrocitos a partir de nervio óptico de rata perinatal (P12). Estos cultivos fueron estimulados con agonistas de los receptores glutamatérgicos (AMPA o kainato) a concentraciones apoptóticas simulando así el proceso de muerte oligodendroglial que ocurre en la enfermedad. Con el fin de obtener una visión global de los cambios que ocurren en la célula se realizó un análisis de expresión génica diferencial con chips de expresión (Affymetrix®) en cultivos estimulados y cultivos control. Los resultados fueron validados por PCR cuantitativa a tiempo real obteniéndose una lista de genes cuya expresión varía tras la aplicación de los estímulos. Uno de ellos, Dusp6, resultó estar implicado en el proceso de muerte exitottóxia ya que la inhibición de su síntesis mediante oligonucleótidos antisentido resultó en un aumento de la supervivencia celular tras la aplicación de estímulos excitotóxicos, lo que supone un punto de partida para el diseño de nuevos tratamientos.

Autor: JUSTO FERNÁNDEZ ALFREDO.
Año: 2005.
Universidad: VIGO.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En la presente tesis se ha estudiado la taxonomía, ecología, corología y fenología de los géneros amanita, limacella, torrendia, pluteus y volvariella en la península ibérica e islas baleares. Se ha obtenido un catálogo de 94 táxones repartidos de las siguiente manera: amanita (43), lamacella (5), torrendia (1), pluteus (33) y volvariella (12). Se proponen 2 nuevas especies para la ciencia y se citan 2 táxones por primera vez en el continente europeo.

Autor: SEPÚLVEDA JUSTO MARIA DEL ROSARIO.
Año: 2005.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Autor: SEGRELLES HUELGA CARMEN.
Año: 2005.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FAACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: CIEMAT (CENTRO DE INVESTIGACIONES ENERGÉTICAS MEDIOAMBIENTALES Y TECNOLÓGICAS).

Resumen: Los cánceres de origen epitelial constituyen más del 80% de todos los cánceres diagnosticados en humanos. Por este motivo, son numerosos los estudios que se realizan para tratar de establecer las alteraciones causantes de esta transformación neoplásica. En muchas ocasiones, este proceso es consecuencia de alteraciones en oncogenes y/o genes supresores tumorales que codifican para proteínas que forman parte de vías de transducción de señal implicadas en la homeostasis celular. Gran parte de estos estudios se llevan a cabo a través de modelos animales. En este sentido, el modelo de carcinogénesis química en piel de ratón (DMBA/TPA), es uno de los modelos mejor conocidos de inducción de carinogénesis química. En este modelo, los datos que se muestran en esta tesis revelan que la señalización mediada por la quinasa Akt (PI3K/Akt) es un mediador esencial en el desarrollo de la carcinogéneiss en piel de ratón. Además, los estudios de tumorigénesis in vivo demuestran que la sobreexpresión de Akt en la línea de queratinocitos PB aumenta su capacidad tumorigéncia. Los tumores obtenidos pro microinyección de estos queratinocitos transformados muestran un cinética de aparición acelerada un mayor tamaño y un mayor grado de malignidad. Esta transformación mediada por Akt se traduce en un aumento de la estabilización de beta-catenina en el citoplasma, un aumento en la transcripción, traducción y localización de ciclina D1 y un aumento en la transcripción, traducción y estabilidad del oncogén c-myc, lo que produce en la célula una desregulación en los procesos de proliferación y apoptosis. Además, la activación de Akt en los queratinocitos conduce al disparo de los mecanismos angiogénicos, a través de una regulación post-transcripcional de VEGF, posibilitando así un mayor crecimiento tumoral. Por último los animales transgénicos que expresan una forma permanentemente activa de Akt desarrollan tumores espontáneos lo que confirma en papel de akt en el desarrollo de la tumorigénesis epitelial.

Autor: GARCÍA-ARANDA JIMENEZ CRISTINA.
Año: 2005.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En los últimos años se ha desarrollado un interés creciente, por parte de investigadores básicos y clínicos, para trabajar conjuntamente sobre un tema de una enorme trascendencia social, como es el cáncer. Mientras que las cifras sobre la incidencia de cáncer son alarmente, estos números oscurecen el hecho de que, a nivel celular, la transformación maligna es extremadamente rara. En realidad estamos protegidos eficientemente de la tumorigénesis por un complejo conjunto de mecanismos de defensa y el desarrollo tumoral sólo es posible cuando se inactivan estos mecanismos. A medida que se conocen las rutas a través de las que se controla la supresión tumoral, se desvelan distintos puntos de regulación críticos que están frecuentemente alterados durante la progresión maligna. El acortamiento de los telómeros y la represión de la telomerasa, en la mayoría de los tejidos somáticos humanos, constituye una importante barrera que nos protege frente al cáncer. Por el contrario, la estabilización de los telómeros, generalmente a través de la activación de la telomerasa, es un paso crítico para la proliferación celular indefinida, y, por tanto, para la formación de tumores. Este hecho ha conducido a un gran interés por identificar la función de los telómeros y la telomerasa en el procesos tumorigénico, con el fin último de su utilización como dianas terapéuticas para imitar el crecimiento exponencial de las células transformadas. La investigación de la dinámica de los telómeros nos proporciona una excelente oportunidad para comprender los mecanismos de control de la proliferación celular. En esta Tesis se ahonda en la comprensión del contexto y los mecanismos por los cuales los telómeros y la telomerasa contribuyen al desarrollo de distintos tipos de tumores humanos, como son el cáncer colorrectal, el cáncer gástrico y el cáncer no microcítico de pulmón. El análisis con fines pronósticos de distintos parámetros de función telomérica en estos tumores ha revelado que en el caso del cáncer colorrectal y del cáncer no microcítico de pulmón, los tumores que no reactivan la telomerasa confieren un pronóstico más favorable que aquellos en los que se detecta actividad de la enzima, mientras que en tumores gástricos la reactivación de la telomerasa no parece tener impacto pronóstico. En los tres tipos de tumores, nuestros resultados indicaron la ausencia de asociación significativa entre la actividad telomerasa y la longitud telomérica, y que los mecanismos de mantenimiento de telómeros alternativos en la enzima constituyen un evento de muy escasa importancia. El análisis de la longitud telomérica en las tres patologías reveló la importancia de este estudio con fines pronósticos, así como un papel dual de los telómeros en los procesos tumorigénicos. En el caso de cáncer colorrectal, hemos podido demostrar in vivo el papel que desempeña la proteína TRF1 como regulador negativo de la longitud de los teloméros. TRF1 se encuentra sobreexpresada en tumores colorrectales, y sus niveles resultan significativamente más elevados en los casos que muestran acortamiento telomérico. Su análisis permite seleccionar grupos de pacientes con un pronóstico más favorables dentro de los casos que reactivan la telomerasa. Además de los distintos parámetros de función telomérica, se investigó del papel de los genes supresores de tumores p53 y p16, en el contexto de la biología de los telómeros. Encontramos que las alteraciones en estos genes son frecuentes en las neoplasias colorrectales y tienen importantes repercusiones en la pérdida de control del crecimiento, propia de las células tumorales. Consideramos que el presente estudio puede ser de utilidad en la clínica oncológica humana para la selección de pacientes con diferentes evolución clínica tras cirugía curativa, a fin de instaurar protocolos terapéuticos adecuados a cada grupo de pacientes.

Autor: FERNÁNDEZ MILLÁN ELISA.
Año: 2005.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.

Resumen: La presente Tesis se ha llevado a cabo en un modelo animal de subnutrición proteico-energética en donde previamente se ha mostrado que una restricción del 65% de la ingesta a la madre durante la tercera semana de gestación aumenta, en los fetos a término, la masa de células beta y la respuesta insulino-secretora a glucosa y aminoácidos. Cuando la subnutrición se prolonga durante el periodo postnatal hasta la edad adulta, aparece la situación contraria: una reducción de la masa de células beta paralela a un daño en la respuesta insulino-secretora. El estudio de los procesos metabólicos y moleculares responsables de estas alteraciones causadas por la malnutrición globalha sido el objetivo principal de esta Tesis. Como resultado se han llegado a las siguientes conclusiones: 1,- La restricción de la ingesta a la madre durante el último tercio de la gestación, provoca en los fetos a término un aumento de la respuesta insulínica a glucosa, debido a un mayor contenido pancreático de insulina y a un incremento en la expresión del gen que la codifica. Este aumento de la expresión de insulina parece estar relacionado con los elevados niveles proteicos de la p38/SAPK2, kinasa implicada en la translocación al núcleo del factor de transcripción del gen dela insulina, el PDX-1. Además el mayor metabolismo oxidativo de la glucosa que presentan estos animales podría estar potenciando la activación de p38/SAPK2 y, en consecuencia, de PDX-1. 2,- La subnutrición crónica, desde la etapa fetal hasta los 70 días de vida, produce una disminución de la insulina liberada en respuesta a glucosa, como consecuencia de un menor contenido pancreático de insulina y de la expresión del mRNA de la hormona. Dicha disminución parece estar directamente relacionada con los bajos niveles pancreáticos de PDX-1 encontrados en las ratas adultas subnutridas. Asimismo, la activación de este factor de transcripción podría estar igualmente reducida como consecuencia del menor metabolismo oxidativo de la glucosa observado en estos animales. 3,- El incremento de la masa de células beta, presente en los fetos a término procedentes de madres subnutridas, parece estar relacionado con un aumento de la replicación de dichas células debido a los elevados niveles pancreáticos de IGF-1. Este hecho se ve favorecido por el mayor numero de receptores de IGF-1 que presentan los islotes fetales y, por la elevada expresión en páncreas de la proteína transportadora IGFBP-2. Por lo tanto, la acción local del IGF-1 parece proteger al páncreas endocrino fetal del impacto de la subnutrición materna en un momento clave para el desarrollo y crecimiento de las células beta. 4,- La subnutrición materna provocó en los fetos a término un aumento del contenido en islote de IRS-2 y de la activación de la vía IRS-2/PI3K/Akt, tanto en estado basal como tras la estimulación con glucosa e IGF-1. Todos estos cambios moleculares parecen ser los responsables de la mayor replicación de células beta encontrada en los fetos subnutridos y, por tanto, podrían estar contribuyendo al aumento de su masa de células beta. 5,- Las células beta de las ratas adultas subnutridas mantienen la capacidad de regenerar espontáneamente tras el estímulo de la pancreotomía parcial del 90%. En este proceso interviene activamente el IGF-1, cuya sobreexpresión en páncreas, como respuesta a la pancreotomía, promueve en las ratas subnutridas la regeneración de las células beta a través de la estimulación, a corto plazo, de las neogénesis, y a más largo plazo de la replicación, con una eficacia superior a la observada en la población control. Creemos por tanto que nuestro modelo animale de subnutrición intrauterina y crónica, es una herramienta muy útil para analizar, in vivo e in vitro, los efectos que distintos factores puedan tener sobre el desarrollo, crecimiento y regeneración de las células beta pancreáti 8 cas.

Autor: RODRÍGUEZ HERNÁNDEZ CARLOS JAVIER.
Año: 2006.
Universidad: POLITÉCNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: Dep. Biotecnologia.
Centro de realización: Universidad de la Laguna.

Resumen: El inmunosupresor FK506 (Tacrolimus, Prograf) ha incrementado la tasa de supervivencia del trasplante de órganos. FK506 ejerce su acción inmunosupresora mediante la inhibición de la fosfatasa calcineurina en células T activadas. Desgraciadamente, la terapia con FK506 está asociada con efectos no terapéuticos indeseados, entre los que destaca la diabetes, que implican otras dianas distintas de calcineurina. Para identificar estas dianas hemos estudiado la toxicidad celular de FK506 en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. FK506 aumentó la sensibilidad de la levadura a estrés osmótico de un modo independiente de calcineurina y las proteínas de unión a FK506. FK506 también indujo un fuerte ayuno de aminoácidos y la activación de la ruta de control general de nutrientes (GCN). La prototrofía de triptófano o el exceso de triptófano eliminó la toxicidad de FK506, lo que muestra que el ayuno de triptófano media este efecto. La mutación de los genes GCN3 y 4 alivió parcialmente la toxicidad de FK506, lo que sugiere que la activación de la ruta GCN por FK506 también está implicada en la tolerancia osmótica. FK506 reforzó la fosforilación de la kinasa Hog1p dependiente de estrés osmótico pero sin inducción de un reportero dependiente de Hog1p. Interesantemente, la interrupción del gen GCN2 suprimió la hiperfosforilación de Hog1p dependiente de FK506 y restauró la actividad del reportero dependiente de Hog1p. A la inversa, la interrupción del gen HOG1 afectó a la activación de Gcn2p y traducción de un reportero GCN4-lacZ dependientes de FK506. Esto pone de manifiesto la existencia de una interacción funcional entre las kinasas Gcn2p y Hog1p. En conjunto estos datos demuestran que tanto el ayuno de aminoácidos como la activación de la ruta GCN inducidos por FK506 contribuyen a la sensibilidad celular a estrés osmótico y revelan un bucle regulador positivo entre las rutas GCN y HOG.

Autor: TÁRRAGA HERRERO SUSANA.
Año: 2006.
Universidad: POLITÉCNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: Dep. Biotecnologia.
Centro de realización: Universidad Politécnica de Valencia.

Resumen: Las plantas, a lo largo de la evolución, han desarrollado numerosos mecanismos para protegerse frente al ataque de los patógenos. Algunos de estos mecanismos son constitutivos, estando establecidos en la planta antes de la llegada del patógeno, mientras que otros se inducen tras la percepción de señales derivadas del ataque patogénico y pueden proporcionar protección no sólo en el sitio de infección sino sistémicamente, a lo largo de toda la planta. Numerosos estudios indican que el ácido salicílico (SA) desempeña un papel fundamental en el establecimiento de las respuestas defensivas. La más inmediata es un aumento muy significativo de sus niveles de acumulación frente a infecciones necrotizantes, tanto en el sitio de infección como en zonas distales de la planta. Además, la aplicación exógena de SA induce resistencia sistémica, lo que implica, entre otras cosas, una acumulación de proteínas defensivas, como son las proteínas relacionadas con la patogénesis (PRs). Estudiando la posible implicación de otros compuestos fenólicos en la ruta de señalización de la respuesta defensiva en plantas, se ha descrito, en nuestro laboratorio, que el ácido 2,5-dihidroxibenzoico o ácido gentísico (GA), muestra un importante incremento de sus niveles de acumulación en infecciones no necrotizantes. Este compuesto, derivado metabólico del SA, al ser aplicado exógenamente en plantas de tomate, induce un conjunto de proteínas PR distintas a las que induce el SA, por lo que podría tener un papel complementario al del SA en la señalización frente a patógenos en plantas. Tanto el SA como el GA, al igual que ocurre con muchos otros metabolitos secundarios, son acumulados en la planta en forma de glicoconjugados. Las reacciones de glicoconjugación consisten en la unión de una o varias moléculas de azúcar a un metabolito en cuestión y son catalizadas por enzimas pertenecientes a la familia de las glicosiltransferasas. Esta conjugación modifica la estructura, estabilidad y propiedades

Autor: CAPARRÓS MARTÍN JOSÉ ANTONIO.
Año: 2006.
Universidad: POLITÉCNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: Universidad Politécnica de Valencia.
Centro de realización: Universidad Politécnica de Valencia.

Resumen: Hemos aislado dos genes de Arabidopsis thaliana, AtGpp1 y AtGpp2, por homología con las fosfatasas de levadura de bajo peso molecular Gpp1 y Gpp2, las cuáles muestran especificidad por DL-glicerol-3-fosfato, y además comparten homología con DOG1 y DOG2 que defosforilan 2-deoxiglucosa-6-fosfato. Usando una aproximación de genómica comparativa, los genes se identificaron como putativas proteinas hidrolasas similares a las dehalogenasas haloácidas. AtGpp1 (gi 18416631) y AtGpp2 (gi 18423981), codifican proteínas que comparten un 95% de identidad, con una MW predecida de 33 y 27 KDa y un pI de 7.8 y 5.6 respectivamente. Ambas isoformas tienen alta especificidad por DL-glicerol-3-fosfato, pH óptimo a 7.0, y una Km en el rango de 3.5-5.2 mM. AtGpp1 y AtGpp2 se expresan a lo largo del desarrollo en todos los órganos de la planta, mayormente en silicuas, y la expresión no se ve afectada por estrés osmótico, iónico u oxidativo. Unido al extremo N-terminal de AtGpp1 existe un putativo péptido de tránsito al cloroplasto cTP, AtGpp2 que carece de esta señal se predice como citosólica; esta compartimentación fué confirmada mediante un fraccionamiento subcelular. El estudio de localización inmunohistoquímica, usando anticuerpos anti-AtGpp2, indica que las proteínas AtGpp están principalmente localizadas en los meristemos de flores inmaduras y en los elementos vasculares de la raíz, el tallo, las hojas, las silícuas y el embrión en desarrollo, concretamente en el citosol al igual que en los cloroplastos de distintos tipos celulares de Arabidopsis, siendo llamativa la particular localización en las células acompañantes del tejido floemático. Las plantas transgénicas de Arabidopsis, que sobreexpresan AtGpp2, presentan una actividad fosfatasa alterada y una tolerancia mejorada al estrés salino, osmótico y oxidativo.

Autor: MARCO MARÍN CLARA.
Año: 2006.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOMEDICINA DE VALENCIA.

Resumen: Durante mi trabajo de tesis, me he ocupado de cuatro enzimas que tienen como función específica la síntesis y liberación de anhídridos fosfóricos, y que son cruciales para la biosíntesis de los aminoácidos ornitina/arginina, prolina, lisina e isoleucina, y para la síntesis microbiana de nucleátidos de pirimidina. Previamente a mi incorporación en el laboratorio, éste había identificado un plegamiento característico y novedoso común a los enzimas carbamato quinasa (Marina, A. et al., 1999; Ramón-Maiques, S. et al., 2000) y acetilglutamato quinasa (Ramón-Maiques, S. et al., 2002). Ambos enzimas, pertenecen al grupo de la Enzyme Commission EC 2.7.2, transferidores de un fosforilo a un grupo carboxilato, y por tanto, con la misión específica de sintetizar anhídridos mixtos carboxflico-fosfárico, en rutas de biosíntesis de aminoácidos. Carbamato quinasa y acetilglutamato quinasa, pertenecen a la familia estructural aminoacido quinasa (Base de datos PFAM, familia PFO0696; http.//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam), familia que por similitud de secuencia de aminoácidos, incluye además, a los enzimas aspartatoquinasa, glutamato 5-quinasa, UMP quinasa bacteriana y N-acetil L-glutamato sintasa. Dada la similitud de secuencia entre los enzimas de la familia aminoácido quinasa, el laboratorio propuso que el plegamiento de carbamato quinasa y acetilglutamato quinasa iba a ser común al resto de enzimas de la familia y la puesta a prueba experimental de esta hipótesis ha sido uno de los objetivos principales del laboratorio y de mi trabajo. Parte de mi trabajo inicial, se centra en la acetilglutamato quinasa (NAGK), enzima cuya estructura había sido ya determinada a alta resolución (Ramon-Maiques, et al., 2002), por otros miembros del grupo en el que he desarrollado mi trabajo. Mi trabajo en relación con este enzima fue corroborar mediante mutagénesis dirigida, las inferencias funcionales derivadas del estudio estructural previo. Dada la similitud entre acetilglutamato quinasa y aspartoquinasa (AK), otro enzima de la familia amino ácido quinasa, clave en la síntesis de treonina, metionina, lisina e isoleucina, y con gran potencial desde el punto de vista biotecnológico, utilizamos la información estructural de NAGK, para realizar un trabajo de mutagénesis dirigida de aspartoquinasa, cuyos resultados nos han permitido construir un modelo estructural de AK, que es hasta el momento la mejor aproximación a la estructura de este enzima. El tercer enzima que he estudiado, la UMP quinasa, es clave en la síntesis de nucleátidos de pirimidina y presenta la peculiaridad dentro de los enzimas de la familia aminoácido quinasa de sintetizar la formación de un anhídrido fosfárico-fosfárico. Mi trabajo con este enzima se ha centrado en determinar su estructura mediante difracción de rayos x. Por último he estudiado el enzima glutamato 5- quinasa, clave en la síntesis de prolina en microorganismos y plantas, que es también clave para la síntesis de ornitina en animales. He determinado la estructura tridimensional de la glutamato 5-quinasa de E. coli mediante difraccian de rayos X. El ámbito de estudio con los cuatro enzimas objeto de esta tesis, ha sido siempre el estructural, buscando conectar y asociar rasgos estructurales con comportamiento funcional. El trabajo que he realizado, ha dado lugar alas siguientes publicaciones: -Site-directed mutagenesis of Escherichia coli acetylglutamate kinase and aspartokinase III probes the catalytic and substrate-binding mechanisms of these amino acid kinase family enzymes and allows three-dimensional modelling of aspartokinase. Clara Marco-Marfn, Santiago Ramón-Maiques, Sandra Tavarez y Vicente Rubio. Journal of Molecular Biology (2003) 334, 459-476. -First-time crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of a bacterial-archaeal type UMP kinase, a key enzyme in microbial pyrimidine biosynthesis. Clara Marco-Marín, Juan Manuel Escamilla-Honrubia y Vicente Rubio. Biochim. Biophys. Acta. (2005) 1747, 271-275. -The crystal structure of Pyrococcus furiosus UMP kinase provides insight into catalysis and regulation in microbial pyrimidine nucleotide biosynthesis/Clara Marco-Marin, Fernando Gil-Ortiz y Vicente Rubio. Journal of Molecular Biology (2005) 352 8 , 438-45 3e7 4. -A novel two-domain architecture within the amino acid kinase enzyme family revealed by the crystal structure of Escherichia coli glutamate 5-kinase. Clara Marco-Marin, Fernando Gil-Ortiz, Isabel perez-Arellano, Javier Cervera, Ignacio Fita y Vicente Rubio. Aceptado en Journal of Molecular Biology.

Autor: BOURGON BAQUEDANO LUCRECIA CATALINA.
Año: 2006.
Universidad: POLITÉCNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA.

Resumen: Previamente en nuestro laboratorio y como resultado del screening funcional de una biblioteca de cDNA de Arabidopsis, se aisló el cDNA correspondiente al gen SRL1 por el fenotipo de tolerancia a sal que confería su expresión en la levadura Saccharomyces cerevisiae. La proteína codificada en dicho cDNA parecía estar implicada en el procesamiento del pre-mRNA. Ello suponía una novedosa relación entre la tolerancia a sal de las células ecuarióticas y un proceso de gran importancia en el metabolismo celular como es el procesamiento del pre-mRNA. El objetivo de la presente Tesis Doctoral se ha centrado en el análisis bioquímico y funcional de SRL1 y en el estudio del mecanismo de inhibición del splicing en presencia de sal. Para ello se llevó a cabo el estudio de expresión del gen SRL1 en plantas de Arabidopsis thaliana sometidas a diferentes condiciones de estrés. Estos estudios indicaron que dicho gen era activado transcripcionalmente en condiciones de estrés salino, temperaturas altas y bajas, estrés hídrico y tratamiento con ácido abscísico. De forma complementaria el estudio bioinformático de las secuencias promotoras del gen SRL1 indicó la presencia en las mismas de secuencias homólogas a las existentes en otros genes cuya expresión se activaba en las mismas condiciones de estrés. Por otra parte, en el estudio cuantitativo del fenotipo de tolerancia a sal y a sequía en plantas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresaban SRL1, se observó que las plantas transgénicas obtenían un mayor desarrollo tanto vegetativo como reproductivo en comparación con las no transformadas para las condiciones de estrés ensayadas. Mediante la técnica de RT-PCR modificada, obtuvimos la confirmación de que el procesamiento de los intrones o splicing constituía una diana de toxicidad de la sal tanto en planta como en levadura. Del mismo modo observamos que en plantas las sobreexpresión de SRL1 conseguía contrarrestar dicha inhibición. El empleo de anticuerpos policlonales que reconocían la proteína SRL1 permitió inmunolocalizar subcelularmente dicha proteína en raíces de Arabidopsis thaliana y Allium cepa tanto en condiciones normales como tratadas con sal. Su disposición en todos los casos fue coherente con su condición de factor de splicing, dado que se localizó en el núcleo en forma difusa en ausencia de sal para pasar a agruparse en forma de spots en condiciones de estrés salino.

Autor: JAVIER BELLIDO SANCHEZ.
Año: 2006.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El citoesqueleto de microtúbulos está constituido por microtúbulos y proteínas accesorias. Los microtúbulos son polímeros de tubulina, un heterodímero constituido por una molécula de alfa y otra de betatubulina. Tanto la síntesis de los monómeros como la formación del heterodímero son procesos complejos y finamente regulados ya que es necesario asegurar el correcto plegamiento de este para que pueda incorporarse al microtúbulo. En estos procesos además de prefoidina y CCT (que también participan en el plegamiento de actina), están implicados hasta cinco cofactores (p14oCoA, CoB, CoC, CoD y CoE) y la proteína Arl2.P14, CoD y Arl2 participan en el plegamiento de la Beta tubulina. El objetivo principal de la tesis es el estudio de la función de Arl2. Se ha clonado el gen humano en vectores de expresión lo que ha permitido purificar la proteína recombinante. También se han producido anticuerpos policlonales específicos que se utilizarán para determinar la localiación a nivel histoquímico e intracelular de Arl2 en diferentes tejidos y líneas celulares utilizando técnicas inmunocitoquímicas. Además se estudiará la función de p14 en células de mamífero mediante ensayos de inhibición de su síntesis utilizando técnicas de silenciamiento genético. Objetivos: Clonaje de Arl2 en los vectores adecuados para su expresión en bacterias y células ecucarióticas, tanto en su forma 'mild type' como en un 'taG' de histidinas para facilitar su purificación. Producción y purificación de la proteína recombinante. Estudio bioquímico, inmunocitoquímico e inmunohistoquímico de la expresión de Arl2 en diferentes tejidos y lineas celulares. Producción del complejo Arl2-Cod mediante coinfección de células Sf9 con baculovirus recombinantes. Producción y purificación de p14 según la metodología descrita. Estudio del efecto de la inhibición de la síntesis de p14 y Arl2 mediante siRNA en líneas celulares apropiadas que se investigan.

Autor: BOSCH PRESEGUE EULALIA.
Año: 2006.
Universidad: POLITÉCNICA DE CATALUÑA.
Centro de lectura: SALA DE CONFERÈNCIES, EUETIT.
Centro de realización: ETSEIB, PAVELLÓ G Campus SUD.

Autor: VÁZQUEZ MARTÍN ALEJANDRO.
Año: 2006.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGICAS.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: La sintasa de ácidos de grasos es la principal enzima implicada en la síntesis de ácidos grasos. Esta proteína se encuentra sobreexpresada en la mayoría de cánceres humanos y su inhibición induce la apoptosis de las células tumorales. En este estudio hemos evaluado la combinación de tratamientos antineoplásticos con inhibidores de la sintasa de ácidos de grasos en líneas celulares de cáncer de mama. Hemos observado que el tratamiento conjunto potencia los efectos de la antraciclinas, cisplatino y 5-fluorouracilo, es aditivo en combinación con faslodez y antagonista en combinación congefitinib y tamoxifeno. Concluimos que las sintasa de ácidos grasos modula la sensibilidad de las células tumorales a los tratamientos antineoplásicos y es una nueva diana en el tratamiento del cáncer de mama.

Autor: SÁNCHEZ MOLINA SARA.
Año: 2006.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: Mutaciones puntuales convierten a Ras en un oncogén constitutivamente activo con capacidad para transformar la célula. Una de las posibles dianas en este proceso de transformación es la cromatina. En este contexto estudiamos las modificaciones de las histonas y los --- que modifican las histonas en la transformación celular inducido por Ras.

Autor: MARTÍN JAULAR LORENA.
Año: 2006.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: En esta tesis doctoral se ha caracterizado el transporte de arginina en macrófagos primarios derivados de médula ósea e hígado fetal, así como en macrófagos alveolares. Los resultados obtenidos indican que, en condiciones basales, el flujo de arginina en la membrana plasmática de estos macrófagos primarios ocurre básicamente a través del sistema de transporte y +L (mayor 75%), con una pequeña contribución del sistema y+ (mayor10%). La actividad y +L puede ser debida a y+LAT y y+LAT-2. El mRNA de y+LAT1 es el más abundante de todos los correspondientes a transportadores de arginina. La actividad del sistema y+ se debe a la expresión de CAT-1 con contribución de CAT-2 dependiente de la cepa de animales utilizada para el estudio. Las actividades de los sistemas b0,+ y B0,+ no están presentes en estos macrófagos. El tratamiento de macrófagos primarios con estímulos de activación clásica y alternativa induce un considerable incremento del transporte mediado por el sistema y+. E cambio, la proliferación produce únicamente un modesto incremento de actividad y+. Para la activación, pero no para la proliferación, este incremento está mediado por CAT-2B. De hecho, la falta de CAT-2 compromete el transporte y metabolismo de arginina inducido por la activación clásica y alternativa sin comprometer la proliferación. El metabolismo de arginina en macrófago detectivos para CTA-2 es una respuesta del macrófago a situaciones de alta demanda de arginina. En respuesta al tratamiento con GM-CSF los macrófagos primarios incrementa el transporte de arginina través de CATA-2B y su metabolismo a por el enzima Arginasa I. En ausencia de CATA-2 existe una compensación parcial por CAT-1 del efecto de GM*-CSF. En macrófagos defectivos para y+LAT-1 no está comprometido el transporte y metabolismo de arginina en respuesta a la activación o tratamiento con GM-CSF. Sin embargo, existe un incremento en el contenido intracelular de esta aminoácido particularmente cuando el metabolismo a través de arginasa está inhibido. Estos datos sugieren que la salida de arginian a través de y+LAT-1 participa en la regulación del contenido intracelular de este aminoácido.

Autor: MIRONES AGUILAR ISABEL.
Año: 2006.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES ENERGÉTICAS MEDIOAMBIENTALES Y TECNOLÓGICAS (CIEMAT).

Resumen: La angiogénesis consise en la formación de vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes. SE trata de un proceso complejo que requiere la interacción coordinada de múltiples tipos celulares. El factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF) es esencial para la angiogénesis cutánea, sin embargo, aún no se ha caracterizado totalmente la función de otras moléculas de señalización vascular específicas, debido, en parte a un posible efecto por parte del VEGF que enmascare dicha función. En este estudio hemos aislado y caracterizado una línea celular de queratinocitos de ratón, inmortalizada espontáneamente, y deficiente en el VEGF, mediante transferencia génica adenoviral de la recombinasa Cre, subcultivos seriados bajo condiciones controladas y clonaje celular. Los análisis de Southern blot y ELISA confirmaron la pérdida completa del VEGF a nivel génico y proteico, respectivamente, en los clones de queratinocitos tratados con la recombinasa. Se ensayaron las tumorigénicas de las células, así como sus características de crecimiento y diferenciación in vitro e in vivo. La inyección subcutánea en ratones inmunodeficientes determinó la ausencia de potencial tumorigénico de la línea celular defiende en el VEGF. El ensayo de diferenciación in vitro, bajo condiciones de elevada concentración de calcio, determinó que estas células mantienen su capacidad de diferenciación normal. Por otra parte, se ensayaron dos modelos de trasplante de cultivo organotípico a ratones inmunodeficientes (cámaras de silicona y trasplante ortotópico). En ambos csdos, los queratinocitos deficientes en el VEGF fueron capaces de formar una piel normal desde el punto de vista de la arquitectura cutánea y organización epidérmica. Muchos estudios describen el establecimiento de líneas celulares de queratinocitos inmortalizadas mediante oncogenes sin embargo en este trabajo hemos generado una línea celular de queratinocitos de ratón deficiente en el principal factor angiogénico (VEGF), que mantiene intactas las características propias de este tipo celular, constituyendo así una herramienta importante para el estudio de rutas angiogénicas independientemente de la fuerte influencia del VGF.

Autor: ANDREU SOMAVILLA NURIA.
Año: 2006.
Universidad: BARCELONA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: Esta tesis se ha dividido en dos capítulos correspondientes al trabajo realizado dentro de los dos grupos de investigación donde se ha realizado. El objetivo de la primera parte de la Tesis fue identificar nuevos genes humanos siguiendo una aproximación de clonación in silico, utilizando las bases de datos de ESTs y la colección de clones IMAGE disponibles. Identificamos un nuevo gen que recibió el nombre de PALML (Uparalemmin-like) debido a su similitud con la proteína humana PALM (paralemmin), y se mapó en 1p21. PALML se expresa mayoritariamente como un transcrito de 2,4 kb, y tiene una expresión ubicua. Para determinar la implicación de este gen en el reflujo vesicoureteral primario no sindrómico (VUR) se puso a punto la técnica de análisis mutacional SSCP-HD para dicho gen, sólo se encontró un cambio nucleotídico que era silencioso en 1 de los 5 individuos con VUR estudiados. El refinamiento posterior de la localización cromosómica de PALML permitió confirmar su localización en 1p21, excluyendo su implicación en VUR. El estudio continuó con la determinación de la localización subcelular de la proteína PALML, en el citoplasma celular. La segunda parte de la Tesis se ha centrado en el estudio del síndrome de Wiskott-Aldrich. El gen responsable del síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) se denomina WASP, se encuentra localizado en el brazo corto del cromosoma X. Este gen codifica para una proteína que se expresa exclusivamente en células hematopoyéticas, y que está implicada en la reorganización del citoesqueleto de actina y en diferentes vías de transducción de señal. Se han estudiado 35 familias españolas con síndrome de Wiskott-Aldrich y trombocitopenia ligada al cromosoma X, en las que se han identificado 18 mutaciones distintas. En el transcurso de esta Tesis se han identificado 4 mutaciones nuevas que no se había descrito previamente como causantes de enfermedad. Esta enfermedad tiene una herencia recesiva ligada al cromosoma X, por lo que en principio, las mujeres heterozigotas para una mutación del gen WASP son portadoras asintomáticas. Hemos estudiado los casos de 2 mujeres españolas heterozigotas para una mutación en el gen WASP que presentaban síntomas de trombocitopenia. El análisis del patrón de inactivación del cromosoma X en estas mujeres nos ha permitido correlacionar la presencia de síntomas clínicos con una alteración en el patrón de inactivación del cromosoma X (las células hematopoyéticas de estas mujeres tienen inactivo preferente el cromosoma X portador del alelo WASP salvaje). El análisis de las disfunciones celulares asociadas al citoesqueleto de actina en los linfocitos B nos permitió determinar: las líneas de células B derivadas de pacientes con WAS defectos en la reorganización del citoesqueleto de actina en respuesta a la estimulación con bradiquinina, así como en la formación de pseudopodios. La capacidad de formación de pseudopodios en las células B-EBV, así como, la regulación normal del citoesqueleto de actina, en respuesta a la estimulación con brdiquinina, se restablece por transferencia del gen WASP mediante vectores retrovirales.

Autor: FERRER ORTA CRISTINA.
Año: 2006.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE BARCELONA (CSIC).

Resumen: El virus de la Fiebre Aftosa es un prototipo del género Aphthovirus perteneciente a la familia Picornaviridae. Este grupo de virus es uno de los más pequeños y está caracterizado por presentar una única molécula de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva como genoma. La Fiebre Aftosa es la enfermedad más contagiosa que padecen los aritodáctiles (animales de pezuña hendida). Las principales causas de la dificultad para controlar las plagas de fiebre aftosa son la elevada variabilidad en las manifestaciones patogénicas, la diversidad antigénica su fácil transmisión, la capacidad para establecer infecciones persistentes y asintomáticas, y por la limitada eficacia de las vacunas existentes hasta el momento. Muchas de estas causas tiene su origen en la limitada de copia y la ausencia de mecanismos de corrección que presentan las RNA polimerasas dependientes de RNA encargadas de replicar su genoma. Las RpdR son los componentes centrales del ciclo vital de los virus de RNA. En todas las estructuras resueltas hasta el momento se puede observar la estructura en forma de mano derecha, con los subdominos de los dedos, la palma y el pulgar. Estos dominios son similares a los de otros tipos de polimerasas descritos hasta el momento. Las RNA polimerasa son una importante diana terapéutica, y que si se aumenta la tasa de mutaciones de estas polimerasas se puede provocar que este virus se extinga por exceso de mutaciones. El objetivo inicial de esta tesis fue conocer la estructura de la polimerasa 3D del Virus de la Fiebre Aftosa y su funcionamiento, para ello se planteó la resolución de la estructura de la polimerasa en su forma libre y formando complejos con RNA, nucleótidos, análogos de nucleótidos y con la proteína iniciadora de la replicación VPg. Se ha podido resolver la estructura de la polimerasa 3D del VFA, que presenta un plegamiento global en forma de mano derecha cerrada característico de las RpdR, donde se pueden diferenciar los subdominios de los dedos, la palma y el pulgar. En los diferentes complejos realizados con RNA se han podido identificar los nucleótidos que interacciona con el RNA, tanto los responsables de dirigir la cadena molde del RNA hasta el centro activo, como lso que llevan a cabo la reacción de adición nucleotídica. También se han identificado los amino ácidos responsables de la selección del nucleótido entrante. En los complejos de la polimerasa 3D con la proteína VPg se ha descrito el complejo de iniciación de la uridilación, no se han observado cambios conformacionales drásticos de la polimerasa 3D, pero se han podido identificar los amino ácidos responsables del proceso de uridilación y se ha observado la presencia de dos iones en el centro activo de la proteína. Todos estos datos pueden servir de base para el diseño de nuevas terapias antivirales que lleven al virus a la extinción por acumulación de mutaciones.

Autor: MERCHAN STEPHANIE EMILIE.
Año: 2006.
Universidad: POLITÉCNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: Dep. Biotecnologia.
Centro de realización: Universidad Politécnica de Valencia.

Resumen: Los mecanismos de homeostasis de K+ y H+, aunque muy estudiados, siguen siendo procesos conocidos parcialmente. En el caso de la levadura, Saccharomyces cerevisiae, la salida de protones de la célula esta regulada por la H+-ATPasa Pma1p, cuyo funcionamiento depende de la entrada de potasio por medio de los transportadores de alta afinidad Trk1 y Trk2. Estudios genéticos han establecido que el transportador Trk1 esta activado por las quinasas Hal4/Sat4 y Hal5 e inhibido por las fosfatasas Ppz1 y Ppz2. En la relación con la integridad celular, demostramos que las cepas que carecen de los genes PPZ1 y PPZ2 muestran un aumento en la turgencia debido a una acumulación excesiva de potasio, que afecta tanto al tamaño celular como a la tolerancia a altas concentraciones de este ión en el medio externo. También demostramos que el incremento de la turgencia produce un estrés constante en la pared celular de estas cepas. Estos fenotipos son dependientes de la presencia de los genes que codifican los transportadores de potasio de alta afinidad, TRK1 y TRK2 y pueden ser rescatados por la presencia de un estabilizador osmótico. En una segunda parte del trabajo, hemos establecido que Trk1 esta localizado en subdominios de la membrana plasmática llamados "rafts". Además, demostramos que Ppz1 también está localizado en la membrana plasmática, que su localización subcelular se ve modulada según los niveles de expresión de Trk1 y que Ppz1 y Trk1 co-inmunoprecipitan in vivo. Por otro lado, Trk1 aparece fosforilado tanto in vivo como in vitro y su fosforilación in vivo está aumentada en mutantes ppz1 ppz2. Este conjunto de datos apoya la hipótesis que las fosfatasas Ppz son reguladores negativos del transportador de alta afinidad Trk1. Finalmente, observando la progresión del ciclo celular, hemos observado que los mutantes ppz1ppz2 son mas sensibles a agentes que dañan el DNA, presentan un retraso en el desarrollo de la fase S del ciclo celular, y tienen una mayor frecuencia de mutaciones que una cepa silvestre. Además, confirmamos que la combinación de la pérdida de función de los genes PPZ1 y CDC7 es letal. CDC7 es una quinasa necesaria durante la fase S para el reinicio de la progresión de la replicación en las horquillas detenidas. Este fenotipo, como los previamente descritos, es dependiente de la presencia de los genes TRK1 y TRK2. Estos datos, observados en conjunto, sugieren claramente la existencia de un defecto en la maquinaria de la replicación del DNA en condiciones de alto pH y elevada concentración de potasio intracelular.