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BIOLOGIA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS

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21 tesis en 2 páginas: 1 | 2
  • IDENTIFICACIÓN POLIFÁSICA DE BACTERIAS ASOCIADAS AL CULTIVO DE MOLUSCOS BIVALVOS

    Autor: GUISANDE ÁLVAREZ JOSÉ ANTONIO.
    Año: 2001.
    Universidad: VIGO [Más tesis de esta universidad] [www.uvigo.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS DE VIGO.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE VIGO.
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    Resumen: España es el principal país productor de moluscos bivalvos de Europa, concentrándose la mayor parte de esta actividad en Galicia. El cultivo intensivo produce un incremento en los riesgos de aparición de brotes infecciosos, lo que crea la necesidad de realizar un seguimiento y control tanto sobre el entorno de cultivo como sobre los propios moluscos. Los objetivos planteados en estudio son la identificación polifásica de bacterias asociadas al cultivo de moluscos bivalvos, la selección de pruebas fenotípicas diferenciales para su caracterización y el diseño de sondas de olognonucleótidos específicas que permitan su rápida identificación. Un total de 488 cepas aisladas de agua, fitoplancton, semillas, larvas y reproductores de almejas y ostras en Galicia y 51 cepas de referencia fueron caracterizados fenotípicamente mediante taxonomía numérica empleando 92 pruebas fisiológicas, morfológicas y bioquímicas. Distintas especies del género Vibrio fueron identificadas mayoritariamente a partir de muestras de almejas, ostras y del agua de cultivo, mientras que Pseudomonas y Pesudoalteromonas fueron los géneros más frecuentemente aislados a partir de muestras de fitoplancton. En este trabajo se propone un conjunto de pruebas fenotípicas para la identificación presuntiva de los principales grupos bacterianos identificados. Debido a la rápida identificación que permite, estas pruebas serán e gran utilidad para los controles de calidad de moluscos bivalvos, en las plantas de tratamiento industrial o en el trabajo del personal de control higiénico y sanitario. Un total de 71 aislados anaerobios facultativos representantes de los fenones obtenidos mediante taxonomía numérica fueron caracterizados mediante ribotipado. Los perfiles ribotípicos obtenidos fueron incluidos en 9 ribogrupos. Representantes de cada uno fueron analizados filogenéticamente mediante la secuenciación del gen que codifica para el ARNr 16S. La identificación polifásica permitió el aislamiento por primera vez de V.trasmaniensis, V.kanaloae, V.pormeroyi y V.neptunius a partir de cultivos de otras y almejas, y además el diseño de oligonucleótidos específicos que permiten su rápida identificación.
  • EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE LA TUBERCULOSIS EN EL ÁREA DE SALUD DE ELCHE.

    Autor: RUIZ GARCÍA MONTSERRAT.
    Año: 2003.
    Universidad: MIGUEL HERNÁNDEZ DE ELCHE [Más tesis de esta universidad] [www.umh.es].
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: UNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ.
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    Resumen: La aplicación de las técnicas moleculares al estudio de la tuberculosis está produciendo un gran avance en el conocimiento de esta enfermedad. Las técnicas más utilziadas son: RFLP de IS6110 (técnica estandar que estudia una secuencia de inserción), y técnicas basadas en PCR (spoligotypius, VNTR yAFLP, muy útiles como complementos a RFLP de IS6110). RFLP se está utilizando para mejorar los conocimiento sobre la epidemiología de la tuberculosis en las poblaciones, pera no es capaz de discriminar las cepas con menos de 6 copias de IS6110, en estos casos podrían ser útiles las técnicas basadas en la PCR. Nuestros objetivos han sido: 1,- Mejorar el conocimiento de la epidemiología de la ABC en el area de Salud de Elche mediante la aplicación de la técnica de referencia IS6110-RFLP. 2,- Valorar la importancia y utilidad de AFLP como complemento de IS6110-RFLP y un aplicabilidad al estudio de esta enfermedad. 3,- Estudiar la concordancia de la epidemiología molecular con la epidemiología clásica.
  • EL VIRUS DE L'HEPATITS C I LA RIBONUCLEASA P HUMANA: ASPECTES BIOLÓGICS I TERAPÈUTICS.

    Autor: NADAL MATAMALA ANNA.
    Año: 2003.
    Universidad: GIRONA [Más tesis de esta universidad] [www.udg.es].
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: LAB. INVESTIGACIÓN DE MEDICINA INTERNA-HEPATOLOGIA DEL HOSPITAL DE LA VALL D'HEBRON.
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    Resumen: El virus de la hepatitis C (VHC) provoca una hepatitis crónica que afecta a más de 171 millones de personas. Es un virus de RNA de cadena positiva que se clasifica dentro de la familia Flaviviridae e igual que la mayoría de virus de RNA se caracteriza por presentar una tasa de mutación elevada. Una de las principale implicaciones biológicas de la elevada tasa de mutación es la resitencia a los tratamientos. Se buscan pues otras soluciones terapéuticas para combatir el virus entre las que se incluye la utilización de ribozimas dirigidad directamente contra el genoma RNA del virus. La ribonucleasa P (Rnasa P) es un ribozina que está presente en todos los organismos ya que es la enzima responsable de la maduración de los prescursores de RNA de transferencia. Es una endonucleasa de actividad muy específica y se diferencia de los otros ribozimas naturales porqué reconoce elementos destructurales y no en secuencia. Lo más interesante en base a la terapia es que se ha demostrado que se puede dirigir su actividad hacia cualquier RNA utilizando una secuencia guía de RNA que cuando hibrida con el RNA diana, el híbrido imite la estructura secundaria del substrato narural. El objetivo final del trabajo es cortar, in vitro , I'RNA del VHC utilizando el ribozima Rnasa P. Se han estudiado dos modelos de Rnasa P , la Rnasa P humana guiada por secuencias guía externas (EGS) i el RNA M1 de la Rnasa P de E.coli unido a la secuencia guía por el extremo 3' (ribozima M1GS). Antes de dirigir el ribozima, se estudió la estructura y variabilidad de una región del genoma del virus ya que se ha descrito que son factores que pueden limitar la eficiencia de cualquier ribozima. En este trabajo se aportan datos sobre la accesibilidad y variabilidad de una región interna del genomo, la región E2/NS2.Los resultados in vitro muestran que se ha conseguido dirigir tanto la Rnasa P humana como el ribozima M1GS hacía el RNA del VHC y cortarlo en una posición predeterminada como accesible. Del análisis de mutaciones se deduce que la región estudiada es variable. Debida a que la interacción con las secuencias guía es susceptible a la variación de la diana estas mutaciones podrían afectar la eficiencia de corte. Delante de estos resultados y en el caso de proponerse una estrategia terapéutica consistiría en un ataque simultáneo de varias dianas. Por otro lado, se han caracterizado dos cortes observados sobre el genoma del VHC cuando este se incuba con extracto de Rnasa P humana en ausencia de secuencias guía. Para la carecterización se han aplicado diferentes técnicas que se pueden dividir en métodos directos (RNA fingerprinting) i indirectos (inmunoprecipitación y inhibición competitiva). Los resultados demuestran que la Rnasa P humana es la enzima responsable de los cortes específicos que se localizan, uno a la entrada interna del ribosoma (IRES)y el otro en la región codificante estructural y no estructural. La Rnasa P es uno del metabolismo de los tRNAs. Además, si bien es un virus muy variable, estas estructuras deben ser importantes para el virus ya que se mantienen en todas las variantes naturales analizadas. Independientemente se su función, la presencia de estas estructuras replantea la estrategia terapéutica inicial ya que su similitud con eltRNA las hace susceptibles al ataque con Rnasa P, directamente, sin la necesidad de las secuencias guía.
  • CARACTERIZACIÓN DE LAS SUBUNIDADES DE UNIÓN A NUCLEÓTIDO DEL TRANSPORTADOR ABC DE NITRATO/NITRITO DE LA CIANOBACTERIA PHORMIDIUM LAMINOSUM.

    Autor: LLARENA FERNÁNDEZ MARTA.
    Año: 2004.
    Universidad: PAÍS VASCO [Más tesis de esta universidad] [www.ehu.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA.
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    Resumen: En cianobacterias el nitrato/nitrito se transportan al inferior celular mediante un transportador "ATP-binding cassette" (ABC) denominado NRT, compuesto por cuatro subunidades proteicas: NrtA (subunidad periplásmica responsable de la unión del nitrato/nitrito), NrtB (subunidad transmembranal), NrtC y NrtD (subunidades de unión a nucleótido). En la cianobacteria filamentosa, termófila y no fijadora de nitrógeno, Phormidium laminosum se habían identificado los genes nrtA, nrtB y nrtC, que codifican el transportador ABC de nitrato/nitrito, formado parte del operón nir, junto con el gen mirA, que codifica la nitrito reductasa. En este trabajo se ha identificado el gen nrtD, a continuación de mrtC, formando parte del operón nir. La subunidad NrtC del transportador de nitrato/nitrito de P.laminosum se ha purificado a partir de células deficientes en nitrógeno y se ha comprobado que hidroliza ATP in vitro, en ausencia del resto de componentes del transportador. Los genes nrtC y nrtD se han clonado en plásmidos de expresión pQE-9 y se han expresado en E.coli, purificándose como proteínas de fusión a cola de histidinas. Se han caracterizado las subunidades His6NrtC e His6NrtD por su capacidad para catalizar la hidrólisis de ATP, con respecto a su especificidad por varios sustratos y sensibilidad a inhibidores, demostrándose la que ambas proteínas hidrolizan ATP in vitro. Además, mediante elctroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes se ha detectado la formación de homodímeros de NrtC, His6NrtC e His6NrtD. La formación de homodímeros de His6NrtD también se ha comprobado por espectrometría de masas MALDI-TOF.
  • DETECCIÓ I ANÀLISI DE LA PERSISTÈNCIA DE LES BIFIDOBACTÈRIES EN AIGÜES PER A LA DETERMINACIÓ DE L'ORIGEN DE LA CONTAMINACIÓ FECAL MITJANÇANT TÈCNIQUES DE CULTIU I MÈTODES MOLECULARS QUALITATIUS I QUANTITATIUS

    Autor: BONJOCH FORNOS XAVIER.
    Año: 2004.
    Universidad: BARCELONA [Más tesis de esta universidad] [www.ub.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.
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    Resumen: El género Bifidobacterium se ha propuesto como indicador del origen de la contaminación fecal, puesto que ciertas especies de Bifidobacterium spp. Se encuentra solamente en los seres humanos, y otras en los animales se sangre caliente. Estos microorganismos se pueden utilizar para distinguir entre la contaminación fecal humana y animal. Estos se encuentran en una concentración entre de 10 9 y 10 10 UFC/g en heces. Además, su fisiología anaerobia, sus requisitos alimenticios complejos e la inhabilidad de multiplicarse debajo del 30ºC hacen poco probable su reproducción en el medio extraenterico. El objetivo de esta tesis ha sido la optimización de las presentes técnicas para la detección y cuantificación de Bifidobacterium spp.en muestras del agua residual. Los medios selectivos analizados para la detección de Bifidobacterium, Beerens, HBSA y BFM, presentaron unas enumeraciones muy similares en agua residual, mostrando una alta especificidad para la detección de las bifidobacterias. No obstante, el medio Beerens y HBSA recuperaron un número significativamente igual y más elevado de bifidobacterias cultivables que no el medio BFM. La hibridación colonial con la sonda Bif permitió una confirmación práctica de las enumeraciones, dando una corrección de la fracción del crecimiento no específico que dan los medios utilizados. El medio de HBSA permite el cálculo del cociente de bibidobacterias totales respecto las bibidobacterias fermentadas de sorbitol /Y/T) que permitió distinguir el origen de la contaminación fecal. Los valores de este cociente por encima de 0,20 indican un origen humano de la contaminación. Los valores por debajo de 0,20 indican una contaminación de origen animal. En este trabajo se ha desarrollado una PCR múltiple para las especies B.adolescentis y B.dentium como herramienta molecular complementaria para caracterizar el origen de la contaminación fecal en agua. El límite de detección de esta técnica es 10 3 CFU/100mL. Para cuantificar estas especies en el medio ambiente se realizó una PCR cuantitativa para estas dos especies (propuestas como indicadoras de la contaminación fecal humana en agua residual). Esta técnica presenta un límite de detección de 10 4 UCF/100mL. Finalmente, se realizaron estudios de inactivación del género Bifidobacterium en agua de río mediante todas las técnicas desarrolladas en la tesis. El género Bifidobacterium es potencialmente un buen indicador del origen de la contaminación fecal reciente en agua. Pero su persistencia baja en las aguas ambientales es una desventaja cuando la contaminación fecal no es reciente.
  • ANÁLISIS GENÉTICO Y PROTEOMICO DE LA REGULACIÓN DE LOS SISTEMAS DE AUTOINDUCCIÓN EN RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV VICIAE UPM791 Y 3841

    Autor: CANTERO GONZÁLEZ SALAZAR LAURA.
    Año: 2004.
    Universidad: POLITÉCNICA DE MADRID [Más tesis de esta universidad] [www.upm.es].
    Centro de lectura: E.T.S. INGENIERÓS AGRONOMOS.
    Centro de realización: E.T.S. INGENIEROS AGRONOMOS.
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    Resumen: La rizosfera es la zona del suelo modificada por la presencia y los exudados de las raíces de las plantas. Como consecuencia existe en ella mayor actividad microbiana que en el resto del suelo, y es en la rizosfera donde tiene lugar el inicio de la interacción simbiótica entre la bacteria fijadora de nitrógeno Rhizobium y la raíz de la leguminosa. %&/Investigaciones reciente han puesto de manifiesto la existencia de sistemas de autoinducción ("quorum sensing") en muchos Rhizobium, que pueden jugar un papel importante en las primeras etapas del reconocimiento y colonización de la rizosfera de la leguminosa huésped (Rodelas et al. 1999). Los sistemas de autoinducción son sistemas de comunicación química intercelular que permiten a las células bacterianas detectar el tamaño de la población en que se encuentran. En los casos mejor estudiados, las señales químicas son moléculas de acil-homoserian lactonas (AHLs), que por su estructura, atraviesan libremente las membranas celulares. Estas moléculas que se sintetizan a niveles bajos normalmente, actúan como co-inductoras o co-represoras de sistemas génicos por encima de un nivel umbral. Precisamente debido a su estructura química que les permite entrar y salir libremente de las células, este umbral únicamente se alcanzará para una célula determinada cuando un número suficiente de células productoras se encuentre en inmediata vecindad con dicha célula. Estos son por tanto sistemas de detección de la densidad celular, y se ha demostrado su importancia en procesos bacterianos en los que el tamaño de la población es importante, como la patogenicidad, la luminiscencia, etc. El sistema más conocido en rizobios es el de Rhizobium leguminosarum bv.viciae A34 en simbiosis con guisantes, gracias a los trabajos llevados a cabo por Downie y cols. (vease revisión Wisniewski-Dyé Downie, 2002). El objetivo principal de esta tesis doctoral se basa en los estudios previos de los sistemas de autoinducción en esta cepa, y consiste en determinar la naturaleza, composición, regulación y función de dichos sistemas de autoinducción en las cepas de Rhizobium leguminosarum bv.viciae UPM791 y 3841. Los objetivos específicos perseguidos en esta Tesis Doctoral son: 1,- Estudio de la producción de moléculas señal del tipo acil-homoserina lactonas (AHLs) en las cepas UPM791 y 3841. Para ello se llevarán a cabo técnicas de cromatografía en capa fina que permitan separar e identificar las distintas moléculas sintetizadas. 2,- Identificación y descripción en ambas cepas de los distintos sistemas génicos de autoinducción responsables de la producción de dichas moléculas, así como su localización en el genoma. Para ello se llevaran a cabo técnicas de biología molecular (PCRs, hibridación con sondas ..) que permitan la caracterización de dichos sistemas. 3,- Búsqueda de genes y proteínas que se encuentren regulados por los sistemas de autoinducción. Para ello se utilizarán técnicas de separación de proteínas mediante geles bidimensionales de alta resolución, que permitan llevar a cabo la comparación de proteomas de las diferentes cepas en condiciones de presencia y ausencia de acil-homoserina lactonas (AHLs). Aquellas proteínas que varíen su expresión podrán ser identificadas por huella peptídica (espectroscopia de masas por MALDI-TOF) y la comparación con el banco de datos nos permitirá conocer la secuencia genómica. 4,- Determinación del papel de los sistemas de autoinducción en la supervivencia y competitividad de R.leguminosarum en la rizosfera y en la superficie de la planta. Para ello se llevaran a cabo estudios funcionales en presencia y ausencia de AHLs que permitan determinar parámetros como la adherencia a la raíz, ó la efectividad en la simbiosis en etapas tempranas y tardías de la interacción con la planta.
  • METABOLISMO DEL CIANURO Y DEL CIANATO EN PSEUDOMONAS PSEUDOALCALIGENAS CECT5344 APLICACIONES BIOTECNOLOGÍCAS

    Autor: LUQUE ALMAGRO VICTOR MANUEL.
    Año: 2004.
    Universidad: CÓRDOBA [Más tesis de esta universidad] [www.uco.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Enlace a esta ficha: http://www.kriptia.com/CIENCIAS_DE_LA_VIDA/BIOLOGIA_MOLECULAR/BIOLOGIA_MOLECULAR_DE_MICROORGANISMOS/1#110038
    Resumen: En Córdoba , la industria joyera genera como consecuencia de su actividad un residuo que contiene elevadas concentraciones de cianuro libre y complejos cianuro-metálicos. Con el objetivo de diseñar un proceso biotecnológico para eliminar estos compuestos tóxicos se ha aislado , a partir de lodos del río Guadalquivir a su paso por Córdoba , una bacteria alcalófica capaz de degradar cianuro en condiciones alcalinas. La bacteria , clasificada como Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344, usa cianuro libre o el residuo de la joyería como fuente de nitrógeno para su crecimiento aeróbico. La ruta de degradación de cianuro en esta bacteria transcurre a través de cianhidrinas, mientras que su capacidad de sintetizar sideróforos le permite utilizar complejos cianurados muy estables, como el ferrocianuro férrico.Una aproximación proteómica ha revelado que en P.pseudoalcaligenes CECT5344 el cianuro induce una proteína que podría participar en la síntesis de sideróforos (fosforribosilglicinamida formiltransferasa)proteinas involucradas en la protección frente a estrés oxidativo (alquil hidroperóxido reductasa y proteína de unión a DNA tipo ferritina), una proteína reguladora normalmente inducida en condiciones de limitación de nitrógeno (PII-2)y una proteína de choque térmico. En P.pseudoalcaligenes CECT5344,el metabolismo del cianato podría depender de un transportador de bicarbonato y se encuantra bajo control por represión catabólica. Este trabajo establece por primera vez una relación entre el metabolismo del cianato y del cianuro, aunque un mutante en el gen cynS indica que el el cianato no esun intermediario obligado en la asimilación de cianuro. Hasta el momento , P. Pseudoalcaligenes CECT5344 es la primera bacteria descrita que degrada cianuro a pH alcalino y en ausencia de glucosa. Todas sus características hacen de esta bacteria un perfecto candidato para su uso en proceos biotecnológicos , como se ha podido demostrar con la destoxificacióm del residuo de la joyería en un biorreactor y con la construcción de un biosensor de cianato.
  • ESTUDIO SOBRE ENZIMAS AMILOLÍTICAS DE LAS LEVADURAS NO CONVENCIONALES PHAFFIA RHODOZYMA Y SCHWANNIOMYCES OCCIDENTALIS.

    Autor: MARÍN ALBERDI M. DOLORES.
    Año: 2004.
    Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [Más tesis de esta universidad] [www.uam.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.
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    Resumen: En este trabajo se ha obtenido una cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae panadera con capacidad amilolítica por inclusión en su genoma del gen SWA 2 de Schwanniomyces occidentales. La nueva cepa contiene DNA exclusivamente de levaduras y presenta un alto nivel de aprovechamiento de almidón. La transformación de las levaduras se llevó a cabo mediante un proceso de integración genómica dirigido allocus ILV2. El gen SWA 2 se expresa de manera constitutiva bajo el promotor ADH 1. Se ha estudiado el crecimiento, aprovechamiento de almidón y capacidad fermentativa de la nueva cepa obtenida. Las pruebas de panaderia realizadas, revelaron que no se producen mejoras significativas al utilizar la cepa transformada de S. cerevisiae. Nos planteamos, por tanto, la coexpresión de la -amilasa SWA 2 con otro tipo de actividades amilolíticas. Para ello, se estudió el sistema amilolítico de la levadura Phaffia rhodozyma, como posible donador de actividades amilolíticas. La levadura Phaffia rhodozyma ha sido ampliamente utilizada en la industria alimentaria ya que produce el pigmento astaxantina. En este trabajo, se estudia el crecimiento de la levadura sobre distintos sustratos y se analiza su sistema amilolítico. Se ha purificado una -glucosidasa extracelular de esta levadura utilizando cromatografía de intercambio iónico. El peso molecular de la proteína purificada es de 115+ - 7% según las pruebas de filtración molecular en condiciones no desnaturalizantes. Los geles SDS-PAGE determinan que la proteína está compuesta de dos subunidades de aproximadamente 60 kDa cada una. Las condiciones de máxima actividad son 45°C y pH 5,5. La enzima presenta una alta actividad sobre maltosa, maltotriosa y oligosacáridos y no hidrolizalos sustratos que estan formados por enlaces a (1,6). La nueva -glucosidasa presenta actividad transglicosidasa y puede ser utilizada para la sintesis de oligosacáridos con capacidad prebiótica. Se han determinado las constantes cinéticas de la enzima sobre diferentes sustratos. Con el objetivo de obtener el gen para la -glucosidasa descrita, se generó una genoteca de ADNc de Phaffia rhodozyma. También se diseñan oligonucleótidos degenerados dirigidos a regiones conservadas de distintas a-glucosidasas, para amplificar secuencias internas al gen mediante PCR.
  • FUNCION DE 6CD17P (RPL33A) EN LA BIOGENESIS DE RIBOSOMAS Y EN EL INICIO DE LA TRADUCCION

    Autor: MARTIN MARCOS MARIA DEL PILAR.
    Año: 2004.
    Universidad: SALAMANCA [Más tesis de esta universidad] [www.usal.es].
    Centro de lectura: CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER.
    Centro de realización: INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA BIOQUIMICA.
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    Resumen: Gcn4p es un activador transcripcional de al menos 539 genes en Saccharomyces cerevisiae. La expresión del gen GCN4 está regulada traduccionalmente en función de la disponibilidad de aminoácidos, por un mecanismo de "reiniciación de la traducción" que depende de cuatro fases de lectura cortas en la región líder del mRNA-GCN4 y por una serie de efectores positivos (GCN) y negativos (GCD). La caracterización genética de un mutante espontáneo gcd17 ha permitido identificar a RPL33A como un nuevo gen GCD, cuyo producto se requiere para la represión traduccional de GCN4 en S. cerevisiae. L33A es una proteína ribosómica esencial de la subunidad 60S que forma parte de una familia muy conservada de proteínas eucarióticas implicadas en unión a tRNAs. La mutación puntual rpl33a-1 determina la sustitución de la glicina en posición 76 por una arginina, en un dominio de la proteína L33A muy conservado evolutivamente. Un modelo de la estructura tridimensional de L33A predice que la G76 forma parte de un lazo externo rígido, y que la mutación no alteraría el plegamiento global de la proteína. Mutaciones sintéticas que reemplazan ciertos residuos del mismo dominio por otros básicos tienen las mismas consecuencias fenotípicas que la mutación espontánea rpl33a-1. Tanto la mutación rpl33a-1 como la sustitución de RPL33A por un alelo nulo, provocan múltiples defectos en el procesamiento de los RNAs ribosómicos y en el ensamblaje de las pre-partículas 60S, causando un grave déficit de subunidades 60S maduras en la célula. La carencia de subunidades 60S origina graves defectos en el inicio de la traducción general de mRNAs en la levadura, pero favorece la traducción del mRNA-GCN4 en particular. El mecanismo por el que ocurre este fenómeno en mutantes gcd17 se ha tratado de interpretar proponiendo varios modelos, basados en el de regulación traduccional de GCN4 e integrando los datos obtenidos en este trabajo.
  • CARACTERIZACIÓN DEL GENOMA Y ANÁLISIS DEL REGULADOR GÉNICO DEL BACTERIÓFAGO SE1 DE SALMONELLA ENTERICA

    Autor: Busquets Martí Núria.
    Año: 2005.
    Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [Más tesis de esta universidad] [www.uab.es].
    Centro de lectura: Facultad de Ciencias.
    Centro de realización: Universidad Autónoma de Barcelona.
    Enlace a esta ficha: http://www.kriptia.com/CIENCIAS_DE_LA_VIDA/BIOLOGIA_MOLECULAR/BIOLOGIA_MOLECULAR_DE_MICROORGANISMOS/1#112280
    Resumen: Estudios previos llevados a cabo en nuestro laboratorio han caracterizado estructuralmente y fenotípicamente el bacteriófago SE1. Este bacteriófago presenta una elevada frequencia de transducción, capaz de infectar S. enterica, serovar Enteritidis y serovar Typhimurium. Siguiendo esta linea de investigación, el presente trabajo se ha planteado ampliar la descripción genética de este bacteriófago y caracterizar las distintas funciones del fago SE1 en estado de lisogenia, tales como la conversión lisogénica, la integración y su regulador o interruptor genético. La sequenciación del genoma del bacteriófago SE1, a partir de una genoteca fágica y por walking directamente sobre el genoma, ha permitido determinar que tiene una longitud de 41.941 pb, que se concreta en 67 orf. La comparación con la base de datos del GenBank ha revelado que este fago, como otros fagos lambdoides, es un mosaico genético resultado de recombinaciones y transferéncias horizontales con otros bacteriófagos. La sequencia obtenida permitió mostrar que la deficiencia en el extremo carboxi terminal periplasmátic de la proteína codificada por uno de los genes de conversión lisogénica (GtrC) podría ser la causa por la qual el bacteriófago P22 sería capaz de infectar una célula lisógena por el bacteriófago SE1. Además, en el presente trabajo se han determinado las sequencias de los operadores de la región reguladora que interaccionan con la proteína cI del interruptor o regulador genético. A través de ensayos de retardo electroforético (EMSA) y de footprinting se ha definido la sequencia concenso de los motivos de unión de los operadores a la proteína cI siguiente: AtAN3tTN3TATT. Por otro lado, el análisi de la composición de la unidad transcripcional del gen cI por RT-PCR pirmitió determinar que el gen orf23 formaba parte de ella. La proteína Orf23 seria un potencial regulador miembro de la superfamilia de ATPasas relacionadas en la partición genómica. Mutantes defectivos en este gen presentan un augmento de la inducción del ciclo lítico en presencia de mitomicina C, cosa que indica que esta proteína podría ser un modulador de la proteína cI o que podría interaccionar con ella. Esta es la primera vez que se caracteriza una proteína de esta superfamília de ATPasas en un bacteriófago que se integra en el genoma de su hospedador.
  • EL CANAL DE POTASIO KV1.3 PAPEL FISIOLÓGICO Y BIOLOGÍA DEL COMPLEJO FUNCIONAL.

    Autor: VICENTE GARCÍA RUBÉN.
    Año: 2005.
    Universidad: BARCELONA [Más tesis de esta universidad] [www.ub.es].
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA UNIVESIDAD DE BARCELONA.
    Enlace a esta ficha: http://www.kriptia.com/CIENCIAS_DE_LA_VIDA/BIOLOGIA_MOLECULAR/BIOLOGIA_MOLECULAR_DE_MICROORGANISMOS/1#112725
    Resumen: En esta tesis doctoral se presentan los estudios realizados sobre Kv1.3, uno de los canales de potasio existentes en macrófagos y su regulación ante distintos estímulos de proliferación y activación celular. En concreto, en la primera contribución que se adjunta se describe cómo los canales de potasio Kv1.3, Kv1.5 y Kir2.1 son los responsables de las corrientes de salida dependiente de voltaje y de rectificación de entrada que se detectan en estas células. En este trabajo se muestra cómo Kv1.3 y Kir2.1 están altamente regulados tanto por el factor de crecimiento MCSF, como por factores inductores de la activación de los macrófagos como son ellipopolisacárido y la citoquina TNFa, existiendo cambios electrofisiológicos en la corriente Kv. Estos estudios muestran cómo, no sólo Kv1.3 se ve regulado en los procesos de proliferación y activación, sino que se requiere su participación en estos procesos. Como complemento a esta regula(!ión se adjunta un trabajo donde se muestra que esta modulación es un mecanismo general que puede ser importante en diferentes patologias sistémicas en las que estos mediadores estén presentes como caquexia, sepsis o inflamación crónica. Por otro lado, un segundo apartado en esta tesis doctoral se centra en los cambios electrofisiológicos que presentan en la Kv en proliferación y activación. Se analiza la posibilidad de que sean debidos a cambios en la composición del complejo funcional.En este sentido se presenta una contribución donde se describe la presencia en macrófagos de todas las subunidades Kv¡3 estudiadas menos la Kv¡34. La proliferación inducida por MCSF incrementaría la expresión de todas las subunidades auxiliares mientras que distintos estímulos de activación, LPS y TNFa, regulan la expresión génica di estas proteínas de distinta forma. Los parámetros cinéticos de la corriente de salida de potasio sobre los que estas subunidades actúan, como son las constantes de activación, inactivación y deactivación, han sido analizados en un intento de relacionar cambios moleculares con cambios electrofisiológfeos en macrófagos proliferantes y activados. Otra aproximación en el análisis de los cambios electrofisiológicos presentes en macrófagos activados se presenta como una publicación en preparación en la que se describe cómo Kv1 .5 es capaz de asociarse con Kv1.3 para formar un complejo funcional generador de corrientes de salida de potasio. En este trabajo se muestran estudios de asociación por microscopia confocal y electrónica junto con estudios de farmacologia que confirman la formación del complejo heteromérico. Los cambios en los parámetros electrofisiológicos de las corrientes, dependiendo de la composición del complejo se han analizado en distintos modelos de expresión heteróloga. Por último se sugiere que, los cambios en el gating que se producen en esta corriente ante distintos estímulos, como el TNFa, podrían deberse a cambios en la estequiometría de las subunidades que conforman el complejo generador de la corriente de salida de potasio en macrófagos. La localización subcelular y el entorno que rodea a las proteínas de membrana son determinantes en la función de éstas. En el tercer apartado de esta mémoria se presentan los estudios realizados sobre la biología celular del complejo formado por Kv1.3, tanto su tráfico a membrana como su localización. Se estudia la influencia de las distintas subunidades presentes en el complejo sobre la biología celular de éste, teniendo en cuenta la influencia de la subunidad Kv1.5 que ya se había descrito en macrófagos, y se acompaña por último de los primeros estudios de internalización del canal a través de vesiculas recubiertas de clatrina.
  • SILENCIAMIENTO GENICO POST-TRANSCRIPCIONAL EN EL HONGO MUCOR CIRCINELLOIDES

    Autor: NICOLAS MOLINA FRANCISCO ESTEBAN.
    Año: 2005.
    Universidad: MURCIA [Más tesis de esta universidad] [www.um.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.
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    Resumen: Mucor circinelloides es un hongo filamentoso que presenta una amplia distribución, encontrándose en el suelo, sobre estiércol y sobre otros sustratos orgánicos en descomposición. Pertenece a la clase Zygomicetes, caracterizada por tener una reproducción sexual por fusión de gametangios, presentar un micelio generalmente cenocítico (en algunas especies pueden aparecer algunos septos), y producir esporas aflageladas e inmóviles. El silenciamiento génico mediado por RNA es un complejo mecanismo de regulación génica, conservado en el mundo eucariota (una notable excepción es S. cerevisie), que conduce a la supresión de la expresión génica mediada por pequeñas moléculas de RNA que inducen la destrucción del mRNA, impiden su traducción o inhiben su transcripción. Inicialmente descrito como un mecanismo de defensa molecular contra virus y transposones, en los últimos años se ha demostrado que este mecanismo también está implicado en la regulación de complejos procesos como la formación de heterocromatina, el desarrollo y la fisiología de los organismos. Además de revelar un mundo de regulación génica hasta ahora desconocido, el silenciamiento génico mediado por RNA se ha convertido en una herramienta fundamental en el estudio de la función de los genes, permitiendo incluso el desarrollo de nuevas disciplinas como la genómica funcional El objetivo global de este trabajo ha sido la caracterización molecular del mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional en el hongo M. circinelloides: M. circinelloides presenta un mecanismo de silenciamiento génico inducido por transgenes que se pone de manifiesto al introducir copias exógenas del gen chivato carB. El fenotipo silenciado es inestable y reversible, y es consecuencia directa de una fuerte reducción en los niveles de mRNA maduro del gen carB. Esta reducción no es debida a una menor tasa de transcripción de dicho gen en los individuos silenciados sino a la degradación del mRNA maduro, indicando que el silenciamiento génico observado es post-transcripcional.El silenciamiento génico en M. circinelloides no está asociado con metilación de las secuencias transgénicas. Sin embargo, sí está relacionado con la presencia de un alto número de copias del transgén, que se mantienen como episomas con estructuras multiméricas. En M. circinelloides, el silenciamiento génico inducido por transgenes está asociado con la presencia de moléculas de siRNAs antisentido y con sentido. Existen dos clases distintas de siRNAs antisentido, de 21 y 25 nt, que se acumulan diferencialmente durante el crecimiento vegetativo del hongo. El silenciamiento en M. circinelloides lleva asociado un proceso de amplificación en el que se producen moléculas de siRNAs secundarios, de las dos clases de tamaño, correspondientes a secuencias localizadas aguas abajo de la molécula inductora. Ambas clases de siRNAs se generan preferentemente a partir de la región 3' del mRNA diana. Se ha clonado el gen dicer1 de M. circinelloides, que cifra una proteína con los dominios estructurales característicos de las enzimas Dicer. La expresión de este gen ocurre a lo largo de todo el crecimiento vegetativo y da lugar a varios transcritos, que se diferencian en el sitio de poliadenilación y/o el procesamiento alternativo de alguno de sus intrones. No se conoce la posible funcionalidad de los transcritos alternativos. El análisis funcional de mutantes nulos para el gen dicer1 indica que dicho gen no es esencial en el mecanismo de silenciamiento y sugiere la existencia de, al menos, un gen dicer adicional. No se descarta, sin embargo, que el gen dicer1 pueda tener una función redundante en el mecanismo de silenciamiento génico. El fenotipo de los mutantes nulos para dicer1 indica que dicho gen está implicado en el crecimiento micelial y la morfología de las hifas, sugiriendo la participación de dicer1 en procesos de regulación endógenos mediados por los miRNAs
  • CARACTERIZACIÓN DE LAS POBLACIONES DE MELVA (AUXIS SPP) POR MÉTODOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y DIFERENCIACIÓN FRENTE A OTRAS ESPECIES DE TÚNIDOS

    Autor: CATANESE GAETANO.
    Año: 2005.
    Universidad: CÓRDOBA [Más tesis de esta universidad] [www.uco.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.
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    Resumen: La melva (Auxis thazard y Auxis rochei) es una de las especies de túnidos con mayor importancia a nivel del sector pesquero andaluz, y más concretamente en la industria conservera. A pesar de su relevancia económica, hasta la fecha no se ha llevado a cabo ningún estudio detallado para determinar el grado de variabilidad genética existente en las poblaciones naturales, ni tampoco se ha desarrollado ningún sistema específico para la autentificación de los productos procesados de melva. En este sentido, la falta de datos moleculares relativos a estas especies ha impedido sin lugar a dudas el abordaje de estas problemáticas. Por ello, en esta Tesis se han aislado y caracterizado marcadores moleculares mitocondriales y nucleares, se han investigado las características genéticas de las poblaciones naturales de A.rochei y se ha desarrollado un sistema de autentificación de productos enlatados. Para ello, se han analizado ejemplares de A.rochei procedentes del Mediterráneo occidental, del Océano Atlántico oriental y del Océano Pacífico oriental. De la especie Auxis thazard se obtuvieron ejemplares procedentes del Océano Indico occidental. Como marcadores mitocondriales, se ha secuenciado los mitogenomas de A.rochei (Atlántico y Pacífico) y A.thazard, así como de los túnidos T.thynnus, T.alalunga, Elalletteratus y K.pelamis. Los tamaños totales oscilaron entre 16.501 y 16.503 pb para A.rochei y 16.506 pb para A.thazard. Al comparar las secuencias se encontraron entre 761 y 773 posiciones polimórficas. El contenido y organización se ajustó al modelo general de vertebrados. El análisis filogenético reveló la existencia de dos linajes mitocondriales (mitotipo I y II) en A.roche. Además, se observó un origen monofilético de A.rochei y A.thazard con respecto al resto de las especies de túnidos. Para el estudio población de A.rochei se analizaron marcadores mitocondriales (citocromo b y región de control) y nucleares (Espaciadores ribosómicos ITS-1 e Its-2 y microsatélites). Ambos marcadores pusieron de manifiesto la ausencia de diferenciación genética entre las poblaciones Atlántica y Mediterráneo. Por el contrario, la población Pacífica mostró una clara separación respecto a las 2 anteriores y para los tres marcadores (cytb Fst entre 0,025-0,031, ITS-1 e ITS-2 Fst entre 0,083-0,087, microsatélites Fste entre 0,015-0,027). Datos biológicos y de aislamiento por distancia explicarían estos resultados. La diferenciación de las muestras del Pacífico apoyarían los datos, descritos por otros autores en base a características morfológicas y merísticas, sobre la existencia de la subespecie A.rochei eudorax en esta región Pacífica. Finalmente, se ha desarrollado y optimizado un sistema de MS-PCR múltiple para la autentificación de productos conservados de melva. Dicho sistema se basó en la amplificación simultánea de tres regiones mitocondriales diferentes: citocromo b, específica de A.rochei, ATPasa 6, específica de A.thazard, ARNr 12S, como control positivo de amplificación. Los ensayos realizados sobre productos en conserva existentes en el mercado han demostrado la especificidad y fiabilidad del sistema para la autentificación de melva.
  • BIODEGRADACIÓN DE SIMAZINA POR MICROORGANISMOS AISLADOS DEL OLIVAR CORDOBÉS

    Autor: SANTIAGO MORA RAQUEL MARIA.
    Año: 2005.
    Universidad: CÓRDOBA [Más tesis de esta universidad] [www.uco.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.
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    Resumen: La generalización del uso de herbicidas en la agricultura actual ha hecho que el estudio de los efectos de estos productos sobre el medio, así como el estudio de los procesos de su degradación adquieran una gran importancia. La simazina es un herbicida triazínico que fue muy utilizado en gran variedad de cultivos, entre ellos en el olivar. En este trabajo se ha cuantificado, mediante PLC, la simazina residual en suelo de olivar de la provincia de Córdoba, sólo en una de las muestras analizadas se detectó una concentración de simazina superior a 0,1 ppm. Se ha determinado la cinética de mineralización de simazina en dos suelos de olivar. Se ha conseguido aislar microorganismos, capaces de crecer con simazina como única fuente de carbono y de nitrógeno. Entre los microorganismos aislados, se encuentran que los que pueden degradar este herbicida aislada y microorganismos, bacterias, que necesitan constituir un consorcio para poder degradar a la simazina. Estos microorganismos, bacterias y hongos, han podido ser identificados o al menos se ha podido determinar el grupo taxonómico al que pertenecen mediante técnicas moleculares. Entre los microorganismos identificados se encuentran Xanthomonas, sp Variovarax sp, Pseudothantomonas mexicana Acidovarax sp y Methylopila capsulata. Se han descrito tres rutas de degradación de simazina diferentes en los microorganismos aislados y se han detectado los genes que codifican a las enzimas implicadas en dicha degradación.
  • CARACTERIZACIÓN DE LOS GENES DE BLAKESLEA TRISPORA IMPLICADOS EN LA BIOSÍNTESIS DE B-CAROTENO

    Autor: PAZ GONZALEZ BEGOÑA.
    Año: 2005.
    Universidad: LEÓN [Más tesis de esta universidad] [www.unileon.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AMBIENTALES.
    Centro de realización: UNIVERSIDAD DE LOEN.
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    Resumen: LOS OBJETIVOS PROPUESTOS AL INICIO DE ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN FUERON LOS SIGUIENTES: 1. DESARROLLO DE UN PROGRAMA DE SELECCIÓN CLÁSICA BASADO EN MUTACIÓN AL AZAR. 2. CLONACIÓN DE GENES DE B. TRISPORA IMPLICADOS EN LA BIOSÍNTESIS DE -CAROTENO, Y/O QUE PRESENTEN UNA EXPRESIÓN CONSTITUTIVA. 3. DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE TRANSFORMACIÓN DE B. TRISPORA. 4. EXPRESIÓN DE GENES BIOSINTÉTICOS DE -CAROTENO EN M. CIRCINELLOIDES Y B. TRISPORA. 5. EFECTO DE LA LUZ SOBRE LA PRODUCCIÓN DE CAROTENOIDES EN M. CIRCINELLOIDES Y B. TRISPORA. SE HAN IDENTIFICADO, CLONADO Y CARACTERIZADO LOS GENES ACTA, CARB Y CARRA. EL ORF DEL GEN ACTA (1.561 PB) POSEE 4 INTRONES, CODIFICA UNA G-ACTINA, Y SU REGIÓN PROMOTORA ES FUNCIONAL EN E. COLI Y A. CHRYSOGENUM. LOS GENES CARB Y CARRA SE ENCUENTRAN LIGADOS EN UNA REGIÓN DE 4,5 KB DEL GENOMA DE B. TRISPORA, Y SE TRANSCRIBEN EN SENTIDOS OPUESTOS BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR BIDIRECCIONAL DE 611 PB. EL ORF DEL GEN CARB (1.955 PB) POSEE 2 INTRONES Y CODIFICA UNA PROTEÍNA CON ACTIVIDAD FITOENO DESHIDROGENASA. EL ORF DEL GEN CARRA (1.894 PB) POSEE 1 INTRÓN Y CODIFICA UNA PROTEÍNA CON ACTIVIDAD FITOENO SINTASA/LICOPENO CICLASA. EL GEN CARB DE LA CEPA SUPERPRODUCTORA DE ?-CAROTENO B. TRISPORA F-744 POSEE LA MUTACIÓN A1791C, QUE ORIGINA LA SUSTITUCIÓN DEL AMINOÁCIDO SER PRESENTE EN B. TRISPORA NRRL 2457 EN LA POSICIÓN 528 POR ARG PRESENTE EN F-744 (S528R). EL GEN CARRA DE LA CEPA F-744 POSEE LA MUTACIÓN T497C QUE ORIGINA LA SUSTITUCIÓN DEL AMINOÁCIDO PRO PRESENTE EN NRRL 2457 EN LA POSICIÓN 143 POR SER PRESENTE EN F-744 (P143S)). LOS GENES CARB Y CARRA DE B. TRISPORA SON FUNCIONALES EN M. CIRCINELLOIDES. EL GEN CARB DE B. TRISPORA COMPLEMENTA LA DEFICIENCIA EN LA ACTIVIDAD FITOENO DESHIDROGENASA DE LA CEPA M. CIRCINELLOIDES MS23, Y EL GEN CARRA COMPLEMENTA LA DEFICIENCIA EN LAS ACTIVIDADES FITOENO SINTASA Y LICOPENO CICLASA DE LA CEPA M. CIRCINELLOIDES MS8. LA EXPRESIÓN DEL GEN CARRA DE B. TRISPORA EN M. CIRCINELLOIDES MS12 INCREMENTA LA PRODUCCIÓN DE G-CAROTENO Y DE LOS INTERMEDIARIOS BIOSINTÉTICOS G-CAROTENO, LICOPENO Y NEUROSPORENO. LA PRESENCIA DE LUZ INCREMENTA LA PRODUCCIÓN DE CAROTENOIDES EN M. CIRCINELLOIDES, MIENTRAS QUE DICHA PRODUCCIÓN DISMINUYE TANTO EN CULTIVOS INDIVIDUALES COMO MIXTOS DE B. TRISPORA. LA PRODUCCIÓN DE CAROTENOIDES EN CULTIVOS MIXTOS DE B. TRISPORA ES NETAMENTE SUPERIOR A LA OBTENIDA EN CULTIVOS INDIVIDUALES DE LAS MISMAS CEPAS. LA TRANSCRIPCIÓN DE LOS GENES CARB Y CARRA DE B. TRISPORA SE ENCUENTRA INDUCIDA EN CONDICIONES DE OSCURIDAD, AL CONTRARIO DE LO QUE OCURRE EN M. CIRCINELLOIDES.
  • KLHEM13, UN GEN HIPÓXICO EN LA BIOSÍNTESIS DE HEMO.

    Autor: Blanco Calvo Moises.
    Año: 2005.
    Universidad: A CORUÑA [Más tesis de esta universidad] [www.udc.es].
    Centro de lectura: Facultad de Ciencias.
    Centro de realización: Facultad de Ciencias.
    Enlace a esta ficha: http://www.kriptia.com/CIENCIAS_DE_LA_VIDA/BIOLOGIA_MOLECULAR/BIOLOGIA_MOLECULAR_DE_MICROORGANISMOS/1#118699
    Resumen: El hemo es una molécula de interés desde el punto de vista del metabolismo energético, puesto que además de intervenir en la captura y el transporte del oxígeno (indispensable para el proceso de obtención de energía vía respiración) tambien forma parte como elemento funcional de las proteinas de la cadena de transporte electrónico y fosforilación oxidativa mitocondrial. Además, en el caso de las levaduras, actúa como un sensor de oxígeno a escala celular e interviene en la regulación génica dependiente de la disponibilidad de oxígeno. Por tanto, el hemo es una molécula esencial que, dada su importancia, podría ayudar a desentrañar el por qué de las diferencias metabólicas existentes entre las levaduras Kluyveomyces lactis y Saccharomyces cerevisiae y nos proporcionaría herramientas para mejorar su explotación biotecnológica. El gen HEM13 de S. cerevisiae es un gen hipóxico que codifica la enzima coproporfirinógeno oxidasa (CPO) que cataliza el sexto paso de la ruta de biosíntesis del grupo hemo. Tanto el gen como la proteina que genera son puntos clave en la regulación de la síntesis de hemo en S. cerevisiae. Por un lado, la CPO es la primera enzima de la ruta que necesita oxígeno como sustrato en su reacción, de modo que ante una caida de oxígeno puede convertirse en un cuello de botella para la generación de hemo (de ahí que exista una relación directa entre los niveles de hemo y de oxígeno) Por otro lado, ScHEM13 es un gen hipóxico, esto es, incrementa fuertemente su expresión en condiciones de hipoxia. En la regulación de ScHEM13 interviene además el hemo como iniciador de una cascada reguladora que culmina con la represión aeróbica o desrepresión hipóxica del gen. En esta tesis se ha aislado el gen KlHEM13 a partir de una genoteca de K. lactis y se ha llevado a cabo un ensayo de complementación de un mutante Schem13, comprobando que KlHEM13 codifica una CPO tan similar a la de S. cerevisiae que ambas son funcionalmente intercambiables. A raiz de lo anterior se ha desarrollado una predicción de estructura terciaria para la CPO de K. lactis aprovechando la reciente cristalización y determinación estructural de la CPO de S. cerevisaie, observándose un gran parecido entre ambas. Tambien se ha estudiado la regulación de KlHEM13 en respuesta a oxígeno a través de medidas de actividad ?-galactosidasa y northern. KlHEM13 se regula de modo similar a como lo hace ScHEM13, expresándose de forma predominante en hipoxia. Sin embargo, KlHEM13 parece seguir un patrón de regulación distinto al descrito para ScHEM13, puesto que mientras este último se encuentra reprimido por el factor Rox1 en aerobiosis, KlHEM13 no se ve afectado por KlRox1. Así lo revela la débil expresión aeróbica de KlHEM13 en una cepa mutante en el gen KlROX1 que codifica el represor del mismo nombre. Así mismo, parece que KlHEM13 no se encuentra regulado por factores que en S. cerevisiae actúan sobre loa expresión de genes hipóxicos. Tambien se han determinado los puntos de inicio de la transcripción para KlHEM13 y dos de los más intensos se encontraron 3´del primer ATG (ATG1) en pautra de la ORF y 5´de un segundo ATG interno (ATG2). Igualmente se encontraron otros puntos más débiles 5´del ATG1 entre los cuales se encuentra uno, solo presente en condiciones hipóxicas. El análisis de los transcritos mediante RT-PCR revela que hay algunos que presentan los dos ATGs y las fusiones a lacZ utilizando los dos ATGs indican que es probable que se generen dos proteínas (aunque se desconoce si esto ocurre de forma natural) Tambien se ha obtenido un mutante nulo de KlHEM13 no viable en ausencia de precursores de hemo, se ha verificado y se ha medido su actividad CPO así como la de su cepa isogénica silvestre a partir de cultivos aeróbicos y en la fracción soluble celular (libre de mitocondrias y membranas) El mutante nulo de KlHEM13 como era de esperar, no presenta actividad CPO. Pero la cepa silvestre si la presenta con lo que, al menos en las condiciones de ensayo, la CPO de K. lactis es citosólica como lo es su homóloga de S. cerevisiae. Finalmente se ha estudiado, mediante arrays, la regulación transcripcional en respuesta a la disponibilidad de oxígeno de una serie de genes de K. lactis homólogos de los qu 8 e en S. 4e1 cerevisiae codifican factores de transcripción implicados en la regulación génica dependiente de oxígeno. Los genes estudiados fueron: HAP1, ROX1, MOT3 Y MGA2. En K. lactis ninguno de estos genes muestra, tras seis horas en hipoxia, muestran cambios de expresión con respecto a aerobiosis. Dentro de este estudio, tambien se analizó el comportamiento de genes de la ruta de biosíntesis de hemo de K. lactis todavía no estudiados: KlHEM2, KlHEM3, KlHEM4, KlHEM14, KlHEM15. KlHEM14 muestran una ligera inducción tras seis horas en hipoxia, nada comparable con la inducción de casi tres veces que muestra ScHEM14.
  • REGULACIÓN DE LA RESPUESTA A ESTRES GENOTOXICO EN LA LEVADURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE

    Autor: CORDON PRECIADO VIOLETA.
    Año: 2005.
    Universidad: SALAMANCA [Más tesis de esta universidad] [www.usal.es].
    Centro de lectura: CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER.
    Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER.
    Enlace a esta ficha: http://www.kriptia.com/CIENCIAS_DE_LA_VIDA/BIOLOGIA_MOLECULAR/BIOLOGIA_MOLECULAR_DE_MICROORGANISMOS/1#118797
    Resumen: Con el fin de asegurar la integridad del genoma, las células eucariotas han desarrollado mecanismos de supervivencia, denominados "checkpoints", que coordinan la reparación del daño en el DNA con la progresión por el ciclo celular. En la levadura Saccharomyces cerevisiae la quinasa Rad53 es un regulador central de estos mecanismos. A su vez, es una proteína esencial para el crecimiento normal de las células. Mediante el etiquetado del extremo carboxi-terminal de la proteína Rad53 con el epítopo HA hemos generado una cepa mutante caracterizada por una reducción en los niveles de esta quinasa. Las células de levadura portadoras del alelo rad53HA son aparentemente normales, ya que son viables y no presentan defectos obvios en el crecimiento celular. Sin embargo, cuando se exponen al tratamiento con agentes genotóxicos muestran una sensibilidad desigual respecto al tipo silvestre, lo que indica que son defectivas en la activación de algunos checkpoints. Cuando se expone a estas células al tratamiento con hidroxiurea, una droga que inhibe la síntesis de DNA, pierden viabilidad seguramente debido a un colapso de las horquillas de replicación en progreso, según se observa mediante electroforesis bidimensionales de DNA. En cambio, cuando se exponen a dosis subletales del agente alquilante metil-metano-sulfonato, las células rad53HA son más tolerantes que el tipo silvestre a la droga, presentando un mayor crecimiento en su presencia que podría explicarse por en una desactivación prematura del checkpoint. La proteína de fusión es funcional, como se demuestra en ensayos de autofosforilación in situ. Además, su sobre-expresión revierte las sensibilidades a agentes genotóxicos observadas en la cepa etiquetada, lo que indica que los defectos que presenta se deben a los bajos niveles basales de la quinasa. Este trabajo pone de manifiesto que la modulación de la activación de Rad53 es crítica para un funcionamiento adecuado de los checkpoints y que una activación reducida de los mismos causa, frente a determinados agentes genotóxicos, una mayor supervivencia celular en presencia de daño al DNA.
  • CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS GENES TARDÍOS INVOLUCRADOS EN LA RUTA BIOSINTÉTICA DEL ÁCIDO CLAVÁRICO, UN ANTICANCERÍGENO PRODUCIDO POR HYPHOLOMA SUBLATERITIUM.

    Autor: GODIO FERNÁNDEZ RAMIRO PEDRO.
    Año: 2006.
    Universidad: LEÓN [Más tesis de esta universidad] [www.unileon.es].
    Centro de lectura: FACU.DE CIEN. BIOL. Y AMBIENTALES.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES.
    Enlace a esta ficha: http://www.kriptia.com/CIENCIAS_DE_LA_VIDA/BIOLOGIA_MOLECULAR/BIOLOGIA_MOLECULAR_DE_MICROORGANISMOS/1#117091
    Resumen: Se ha desarrollado y optimizado una estrategia efectiva de transformación para H. sublateritium, mediada por A. tumefaciens. Se ha demostrado la importancia de utilizar secuencias promotoras pertenecientes, al menos, a la misma Subdivisión (Basidiomycotina) para transformar eficientemente especies del género Hypholoma. Se ha observado una fuerte relación entre el pH del medio de cultivo y la producción de ácido clavárico en los distintos medios de cultivo ensayados. También se ha observado la influencia de distintos factores sobre la producción de ácido clavárico, como son la adición de cobre, la agitación del cultivo o la suplementación con aceite. Se han identificado en el genoma de la cepa HS898 de H. sublateritium dos genes que codifican para enzimas muy importantes en la biosíntesis de esteroles y ácido clavárico, erg1 y osc1; estos genes fueron clonados y secuenciados. El gen erg1 de 1659 pb, codifica para una proteína de 461 aminoácidos con una masa molecular deducida de 49,079 kDa. La proteína codificada por dicho gen, presenta las regiones conservadas de unión a FAD características de algunas monooxigenasas. La sobreexpresión del gen erg1, conlleva un incremento en la producción de ácido clavárico acorde con el aumento en la dosis génica aunque también aumenta el crecimiento del micelio. La atenuación del gen erg1 genera un fenotipo típico dependiente de ergosterol (los transformantes sólo crecen si al medio de cultivo se añade ergosterol), lo que sugiere que el gen erg1 posiblemente esté involucrado en el metabolismo primario de H. sublateritium, y también en el metabolismo secundario, ya que disminuye la producción de ácido clavárico. El gen osc1 de 2840 pb, codifica para una proteína de 721 aminoácidos con una masa molecular deducida de 82,388 kDa. La proteína codificada por dicho gen, presenta las regiones conservadas "QW" características de la mayoría de las terpenociclasas. La sobreexpresión del gen osc1, conlleva un incremento en la producción de ácido clavárico acorde con el aumento en la dosis génica, sin incrementar el crecimiento del micelio. La disrupción del gen osc1 provoca la interrupción de la síntesis de ácido clavárico. Por otra parte, el crecimiento de los mutantes con el gen osc1 interrumpido es semejante al de la cepa parental, y no requieren suplementación alguna con ergosterol para su normal desarrollo; esto sugiere que el gen osc1 sólo esta involucrado en el metabolismo secundario de H. sublateritium, y concretamente en la vía biosintética del ácido clavárico. La atenuación del gen osc1, ya sea mediante la estrategia de ARN antisentido o por la estrategia de ARN de interferencia confirma los resultados obtenidos al interrumpir el gen osc1. Se obtuvieron en H. sublateritium, mutantes superproductores como subproductores de ácido clavárico. El análisis de los mutantes, reveló que algunos de los genes que se encuentran sobreexpresados en los mutantes superproductores, están directamente relacionados con la biosíntesis de esteroles.
  • DECIPHERING THE ROLE OF PHOP IN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS VIRULENCE.

    Autor: GONZALO ASENSIO JESUS ANGUEL.
    Año: 2006.
    Universidad: ZARAGOZA [Más tesis de esta universidad] [www.unizar.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Centro de realización: DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA.
    Enlace a esta ficha: http://www.kriptia.com/CIENCIAS_DE_LA_VIDA/BIOLOGIA_MOLECULAR/BIOLOGIA_MOLECULAR_DE_MICROORGANISMOS/1#119565
    Resumen: La tuberculosis es en la actualidad una de las principales causas de muerte debidas a enfermedades infecciosas, más de dos millones de personas mueren cada año y la tercera parte de la población está infectada con Mycobacterium tuberculosis. Aunque la tuberculosis es una enfermedad tratable con antibióticos y puede prevenirse mediante vacunación, la aparición de cepas resistentes a los fármacos antituberculosos y la variable eficacia protectora de la vacuna BCG contra las manifestaciones pulmonares de la enfermedad dejan la victoria sobre la tuberculosis fuera de alcance. La búsqueda de una vacuna eficaz continúa, iniciativas conjuntas de laboratorios Europeos y Americanos han hecho posible la construcción de eficaces candidatos a vacuna. De hecho, el punto de partida de éste trabajo ha sido el gen phoP, cuyo papel en la virulencia de M. tuberculosis fue estudiado previamente en nuestro laboratorio en colaboración con el Instituto Pasteur de París. Un mutante phoP construido en la cepa clínica MT103 confiere mejor protección contra la tuberculosis que la actual vacuna BCG en varios modelos animales, estos resultados apuntan a dicho mutante como un prometedor candidato a vacuna viva atenuada. Sin embargo, aunque el fenotipo virulento del mutante phoP ha sido bien estudiado, los mecanismos moleculares que conducen a la atenuación no están caracterizados. Por ello, esta Tesis se ha enfocado a comprender la función del gen phoP y descifrar su papel en la virulencia del bacilo de la tuberculosis. PhoP es un regulador transcripcional que forma parte del sistema de dos componentes (2CS) PhoPR de M. tuberculosis. Los 2CSs median cambios transcripcionales en respuesta a determinados estímulos y están implicados en la regulación de la virulencia en bacterias patógenas. Con el objetivo de caracterizar genéticamente el papel del sistema PhoPR, hemos construido mutantes por delección en el gen phoP o en ambos genes phoPR en tres cepas diferentes de M. tuberculosis. Los análisis bioquímicos de estos mutantes muestran que PhoP regula coordinada y positivamente la síntesis de lípidos implicados en la virulencia de M. tuberculosis. Estos resultados además de constituir una buena explicación para el fenotipo atenuado del mutante phoP representan una de las primeras evidencias experimentales de la regulación transcripcional del metabolismo lipídico en el bacilo de la tuberculosis. Este trabajo también se ha enfocado a comprender el mecanismo de acción del sistema PhoPR. El hecho de que algunos de estos 2CSs autorregulan su propia expresión nos llevó a estudiar la interacción entre PhoP con su propio promotor así como la transcripción del gen phoP. Nuestros resultados demuestran que el mRNA de phoP se sintetiza desde tres sitios de inicio de la transcripción (tsp's) sugiriendo una compleja regulación de su expresión. Además hemos demostrado que PhoP se une a su propio promotor. La región de unión de PhoP incluye los tsp's de este gen. Estos hallazgos sugieren que PhoPR es un sistema autorregulado y nos hace suponer que la expresión de los genes regulados por PhoP depende en gran medida de su propia expresión. Uno de los objetivos más ambiciosos de este estudio ha sido la identificación de los genes regulados por PhoP en un intento por comprender la atenuación a nivel transcripcional de la cepa mutante. Para identificar el regulón de PhoP se han llevado a cabo dos estudios: la identificación de perfiles transcripcionales utilizando microarrays de DNA y el estudio de patrones de expresión mediante electroforesis bidimensional de proteínas. Ambos experimentos muestran una buena correlación, lo que confiere robustez a nuestro estudio. Los resultados indican que PhoP podría estar implicado en la regulación de tres rutas transcripcionales que controlan: la remodelación de la envoltura celular; la adaptación metabólica a la escasez de oxígeno y la respuesta al choque térmico. Estas respuestas transcripcionales están relacionadas con el estilo de vida intracelular de M. tuberculosis y, por tan 8 to con s 4c5 u virulencia, por ello su alteración en el mutante phoP podría provocar atenuación. Aunque el fenotipo atenuado de la cepa mutante debería ser principalmente debido a la mutación en el gen phoP, los propios polimorfismos de la cepa parental MT103 podrían haber contribuido a las características fenotípicas y propiedades vacunales del mutante phoP, por ello, nos propusimos identificar los polimorfismos de la cepa MT103. Los resultados obtenidos mediante microarrays de DNA demuestran la pérdida de algunos genes en la cepa MT103 cuando se compara con la cepa de laboratorio H37Rv.
  • ESTUDIO DEL DAÑO OXIDATIVO EN PROTEÍNAS Y EFECTO DE LA RESTRICCIÓN CALÓRICA EN EL ENVEJECIMIENTO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE.

    Autor: REVERTER BRANCHAT GEMMA.
    Año: 2006.
    Universidad: LLEIDA [Más tesis de esta universidad] [www.udl.es].
    Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA UDL.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUT UDL.
    Enlace a esta ficha: http://www.kriptia.com/CIENCIAS_DE_LA_VIDA/BIOLOGIA_MOLECULAR/BIOLOGIA_MOLECULAR_DE_MICROORGANISMOS/1#122140
    Resumen: S. cerevisiae és un organisme unicel·lular on s'hi han descrit dos tipus d'envelliment, el cronològic i el replicatiu. L'envelliment cronològic es defineix com la capacitat d'un cultiu de mantenir la seva viabilitat al llarg del temps i s'utilitza com a model senzill d'estudi d'envelliment en teixits post-mitòtics. L'envelliment replicatiu es defineix com el nombre de cèl·lules filles que una cèl·lula mare verge pot generar al llarg de la seva vida i es utilitzat com a model d'estudi de l'envelliment en teixits mitòticament actius. La teoria de l'estrès oxidatiu aplicada a l'envelliment proposa que les espècies reactives de l'oxigen (ROS) provoquen un dany progressiu que afecta a DNA, lípids i proteïnes i que té com a resultat el deteriorament cel·lular que caracteritza l'envelliment. Entre les modificacions oxidatives que tenen lloc en proteïnes, la formació de grups carbonil és una de les més estudiades. Es tracta d'una alteració de l'estructura química de tipus irreversible i s'ha descrit que la seva presència augmenta amb l'edat en diversos tipus cel·lulars. En aquest treball s'ha utilitzat una aproximació proteòmica per estudiar l'oxidació de les proteïnes del llevat durant l'envelliment. Com a marcador de dany oxidatiu s'ha utilitzat la formació de grups carbonil. Els resultats indiquen un increment progressiu de dany oxidatiu durant l'envelliment cronològic i replicatiu. En ambdós casos, aquest dany és previngut per la restricció calòrica, l'única intervenció coneguda capaç d'augmentar la longevitat en tots els organismes estudiats. A més, s'han identificat les principals dianes d'oxidació proteica en ambdós tipus d'envelliment que corresponen a proteïnes de resistència a estrès i proteïnes del metabolisme energètic. Per estudiar amb profunditat l'efecte del dany oxidatiu en l'envelliment s'han construït soques amb una còpia addicional de gens d'aquestes proteïnes, la qual cosa ha portat a identificar la soca 2xADH1 com més longeva. Adh1 és una alcohol deshidrogenasa que catalitza l'últim pas de la fermentació de la glucosa en llevat. En aquesta reacció la reducció de l'acetaldehid a etanol va associada a l'oxidació del NADH regenerant el coenzim NAD+. Sir2 és una histona desacetilasa dependent de NAD+ que juga un paper clau en la regulació de l'envelliment replicatiu del S. cerevisiae. Els resultats assenyalen que un augment de l'activitat Adh1 augmenta el ràtio NAD+/NADH i l'activitat de Sir2 promovent l'increment de la longevitat replicativa. D'altra banda, l'augment d'expressió d'Adh1 genera un augment en la taxa de respiració mitocondrial i un augment de les ROS intracel·lulars que porta a la inducció de les defenses antioxidants. Aquest fet permet que la soca 2xADH1 sigui més resistent a un tractament amb H2O2 i presenti una major longevitat cronològica. Tant els fenòmens que incrementen la longevitat replicativa com la cronològica semblen estar connectats ja que s'ha vist que un tractament amb H2O2 indueix l'expressió de Sir2. A més, la deleció de SIR2 suprimeix les diferències de resistència a estrès. Aquestes dades fan pensar en una possible via d'inducció dels sistemes antioxidants on la proteïna nuclear Sir2 tingui un paper clau i d'altra banda posa en evidència el fet que el manteniment de l'activitat d'enzims que participen en l'equilibri NAD+/NADH afectarà l'envelliment replicatiu i el cronològic.
21 tesis en 2 páginas: 1 | 2
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