INGENIERIA GENETICA

Autor: FERNÁNDEZ RODRÍGUEZ MATILDE.
Año: 2003.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La enterocina AS-48 es un péptido circular producido por enterococcus faecalis, que muestra un amplio espectro de acción frente a numerosas bacterias patógenas transmitidas por alimentos y alterantes de los mismos. En esta Memoria se ha completado la caracterización de la región genética responsable del carácter AS-48 clonada en pAM401, que consta de los genes as-48ABCC1DD1EFGH, en la que as-48A es el gen estructural. La caracterización de los productos codificados por los cuatro últimos genes, obtenidamediante análisis fenotípico de los mutantes de inserción con el transposoón Tn5 y la aplicación de programas informáticos de alta fiabilidad, ha permitido conocer que los genes as-48EFGH codifican un transportador de tipo-ABC implicado en al autoprotección frente a AS-48. En este sistema de transporte se ha identificado la función de As-48G, en la que se encuentran los dominios de unión a ATP y la de las proteínas As-48EH que presentan cuatro dominios de expansión en membrana, mientras la proteína As-48F podría aumentar la eficacia del transportador. El análisis de transcripción de la región as-48 realizado mediante Northern Blot, junto a los resultados derivados de los estudios de complementación en trans de los genes as-48ABC en pAM36e llevados a cabo, ha permitido concluir que la región as-48 se encuentra estructurada en dos operones de expresión constitutiva (as-48ABC y as-48C1DD1EFGH) aunque presentan promotores internos que permiten la expresión regulada de los genes as-48BC y as-48EFGH. La región as-48 ha sido clonada en vectores propios bacterias del ácidoláctico (plL253-81 y pEM76-81), pero ninguna de las nuevas construcciones obtenidas ha igualado la eficacia de pAM401-81 en la expresión y resistencia frente a AS-48. La transferencia de la región as-48 a cepas de interés biotecnológico, ha sido realizada con éxito en Lactococcus, Lactobacillus y E.faecium. Las dos primeras sólo mostraron una débil expresión de la resistencia, mientras que todas las estirpes de E.faecium transformadas, expresan el carácter con una eficacia similar a la estirpe salvaje, El. Faecalis S-48. Este resultado es de gran interés aplicado al tratarse de cepas aisladas de alimentos, carentes de determinantes de virulencia, por lo que, en un futuro próximo podrán ser utilizadas en la obtención de alimentos fermentados, en las que se implantan sin ninguna dificultad.

Autor: JARA RAMÍREZ MÓNICA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: Estudios previos llevado a cabo en nuestro laboratorio han analizado el contenido del regulón LexA de las Gamma proteobacterias (Erill et al., 2003). Siguiendo la misma linea, el presente trabajo pretende ampliar la descripción de dicho regulón a otras familias del Dominio Bacteria: Geobacter sulfurreducens, como representante del grupo Desulfuromonas, perteneciente a la subdivisión Delta de las proteobacterias: Fusobacterium nucleatum, del Phylum Fusobacteria; microorganismos pertenecientes a la Clase Alfa de proteobacterias y bacterias gram positivas. En primer lugar, se procedió a determinar las cajas de unión a LexA de los microorganismos G.sulfurreducens y F.nucleatum, para lo cual se clonaron y secuenciaron sus respectivos genes lexA. Tras sobreexpresar y purificar las respectivas proteínas se procedió a realizar ensayos de retraso electroforético y de footprinting, con lo que se definieron ambos motivos de unión a LexA: GGTT N2 C N4 G N3 ACC para G.sulfurreducens y TGTATC N12 TACA para F.nucleatum. A continuación, se estudió in silico la distribución de los motivos descritos en cada genoma. En ambos casos el único gen, a parte del lexA, que resultó estar bajo control de la proteína LexA el fen dinB. En G.sulfurreducens el gen recA, además de no poseer el motivo LexA y de no unirse a dicha proteína, presentó una expresión constitutiva frente al daño en el DNA. Por el contrario, el gen recA de F.nucleatum es inducible por lesiones en el DNA aunque no está regulado directamente por lexA. Una vez descritos estos dos microorganismos se abordó el estudio de microorganismos pertenecientes a la clase Alfa de las proteobacterias y a las bacterias gram positivas. Dado que las cajas LexA de estos microorganismos ya se conocían, se procedió a buscar dichos motivos en sus genomas. Una vez analizados los resultados biocomputaiconales, se procedió en cada caso a validar dichos resultados experimentalmente escogiendo un microorganismos como representantes. Para el caso de las proteobacterias Alfa se escogió a Sinorhizobium meliloti, y como bacteria gram positiva se eligió a Bacillus subtilis. En ambos microorganismos los datos experimentales han coincidido totalmente en los obtenidos in silico. El conjunto de resultados obtenidos ha demostrado la existencia de una gran variabilidad en el contenido del regulón LexA en el Dominio Bacteria. Este hecho sugiere la existencia de una importancia transferencia genética horizontal en el Dominio Bacteria en lo que hace referencia a este regulón.

Autor: CALLÉN MORÉU ELSA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: ESCUELA DE POSTGRADO.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: La anemia de Fanconi (FA) es un desorden genético de naturaleza autosómica recesiva y caracterizado por una seri de malformaciones congénitas, fallo de médula ósea y una elevada predisposición a adquirir tumores sólidos y leucemia mieloide aguda. Las células FA, poseen una elevada inestabilidad cromosómica tanto espontánea como inducida por agents inductors de enlaces cruzados. Otros rasgos celulares son la sensibilidad frente al daño oxidativo, fallos en el ciclo cellular, niveles elevados de apoptosis regulación deficiente de la transcripción y disfunción telomérica. Hasta el momento, se ha descrito que existen 12 genes diferentes que pueden causar esta enfermedad, aunque no todos ellos han sido clonados y caracterizados. De entre ellos, FANCA es el que más frecuentemente se halla mutado entre la población y presenta un amplio espectro de mutaciones, siendo las grandes deleciones una de las principales. Un conocimiento más profundo de la biología de esta enfermedad nos va a permitir adquirir una visión más global de la reparación del adaño en el DNA en respuesta a determinados agentes así como un mejor entendimiento de las interacciones moleculares que se establecen entre distintos síndromes genéticos y que tienen un indiscutible valor diagnóstico y terapéutico. En este trabajo de tesis se han planteado cuatro objetivos principales y generales, que son: * Establecer potenciales relaciones entre las característics hematológicas de la enfermedad y algunas características celulares tales como el acortamiento telomérico y las anomalías cromosómicas numéricas o estructurales. * Caracterizar genéticamente a la población afectada por la anemia de Fanconi española. * Explorar el papel de la ruta FA en la biología y el matenimiento telomérico. * Estudiar la biología molecular de la ruta FA en respuesta al daño genómico. Con los estudios llevados a cabo, se ha observado un acortamiento telomérico acelerado en los pacientes Fanconi acompañado de un incremento en el número de fragmentos extrateloméricos y fusiones, aunque este exceso de fusiones terminales ocurre de manera independiente a la presencia de TRF2 en el telómero. Además, este acortamiento no está directamente relacionado con la severidad de la enfermedad a nivel hematológico. Si que se relaciona, sin embargo con la enfermedad hematológica la frecuencia espontánea de roturas cromosómicas. Por otra parte, se ha estudiado y caracterizado exhaustivamente la población Fanconi española, haciendo especial énfasis en los portadores de mutaciones en el gen FANCA y en la población de etnia gitana, poseedores de la mayor frecuencia de portadores de mutaciones en FANCA a nivel mundial. Un dato importante extraído de estos estudios es la participación de la historia H2AX dentro de la ruta Fanconi en respuesta a la irradicación con UV-C.

Autor: MORALES GERMAN MÓNICA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: ESCOLA DE POSTGRAU.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: El melón (Cucumis melo L.) es una hortaliza de gran importancia económica en la que existen numerosos programas de mejora genética. Uno de los objetivos de estos programas ha sido la incorporación de resistencias genéticas frente a patógenos que provocan importantes pérdidas económicas en este cultivo. El virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) es un Carmovirus endémico de la familia de las Cucurbitáceas cultivadas bajo invernadero. La única resistencia descrita hasta el momento frente a MNSV es la conferida por el gen recesivo nsv de melón. Esta resistencia es efectiva frente a la gran mayoría de aislados conocidos del virus. Se conoce poco sobre el mecanismo de resistencia de la interacción MNSV/nsv. Así pues, el estudio de esta resistencia mediante el clonaje del gen nsv nos permitirá comprender la estrategia que utiliza el virus para infectar a la planta y esta información podrá ser utilizada para un control de este virus. Se conoce poco sobre el mecanismo de resistencia de la interacción MNSV/nsv. Así pues, el estudio de esta resistencia mediante el clonaje del gen nsv nos permitirá comprender la estrategia que utiliza el virus para infectar a la planta y esta información podrá ser utilizada para un mejor control de este virus. El objetivo principal de este trabajo ha sido el clonaje del gen nsv mediante la estrategia de clonaje posicional. En primer lugar, el gen nsv fue cartografiado en el grupo de ligamiento 11 del mapa genético de melón generado en nuestro laboratorio. A continuación, una población de 69 LDHs fue utilizada para obtener marcadores AFLPs y RADPs ligados al gen nsv mediante la estrategia del "Bullked Segregant Analysis". Dos mapas genéticos de alta resolución fueron construidos en dos poblaciones diferentes, una F2 de 408 individuos y un BC1 de 2727 individuos. Los marcadores flanqueantes y los que cosegregaban con el gen la primera población de LDHs fueron convertidos en marcadores de PCr para ser usados fácilmente en estas poblaciones de gran tamaño. Además, dos genotecas de BACs de melón, una generada a partir de un genotipo resistente a MNSV y otra a partir de uno susceptible, fueron examinadas con estos marcadores y se obtuvo un mapa físico de la región del gen nsv mediante paseo cromosómico. En la población F2, los marcadores flanqueantes al gen 1L3 y 5B3sp6 se encontraban separados entre sí por 4 recombinantes, mientras que en la población BC1 los marcadores flanqueantes eran 1L3 y 10O16sp6 y 20 el número de recombinantes entre ellos. La relación distancia física/distancia genética en esta región del genoma de melón se estimó en 228 kb/cM, relación óptima para llevar a cabo el clonaje posicional del gen. Finalmente, se ha llegado a identificar el BAC 1-21-10 que contiene físicamente al gen nsv. La existencia de microsintenia en lar región del gen nsv con una región del genoma de Arabidopsis permitió la identificación de un gen candidato para nsv de una manera rápida. Se identificó el factor de iniciación de la traducción 4E (eIF4E) como el candidato para nsv, que había sido previamente identificado como el responsable de la resistencia frente a potyvirus en pimiento, guisante y lechuga. El desarrollo de un marcador de PCR a partir del eIF4E de melón confirmó que éste cosegregaba con el gen nsv en las poblaciones F2 y BC1. A continuación, la secuenciación completa del ADNc de eIF4E reveló que la única diferencia entre las secuencias del alelo resistente y de dos alelos susceptibles residía en un nucleótido, que correspondía con un cambio de aminoácido en la posición de 228 de la proteína: una leucina en el genotipo resist 8 ente a M 365 NSV y una histidina en los dos genotipos susceptibles. Probablemente, esta mutación en el eIF4E es la responsable de la resistencia presente en PI161375.

Autor: CALERO NIETO FERNANDO JOSE.
Año: 2004.
Universidad: CÓRDOBA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: F. oxysporum secreta durante la infección multitud de enzimas extracelulares que se encargan de degradar la pared vegetal de sus especies vegetales hospedadoras. Un grupo importante de estas enzimas lo constituye el complejo xilanolítico que se encarga de degradarel polímerode xilanoque apareceen la fracción hemicelulósicade la pared vegetal. Se ha aislado el gen foxlnR que codifica una proteína que contiene un dominio de unión a ADN del tipo de binúcleo de zinc. Este gen presenta una transcripción basal que se induce transitoriamente en presencia de una fuente de carbono inductora como el xilano de salvado de avena y que se reprime en presencia de fuentes de carbono represoras, como la glucosa. La transcripción de foxlnR no se ve afectada cuantitativamente por el pH ambiental aunque su inducción ocurre a tiempos distintos según el pH de crecimiento del hongo. La inactivaciónde foxlnR provoca la incapacidad de producir halo de hidrólisis del xilano coloreado en medio sólido y un descenso de la actividad xilanasa en condiciones de inducción en medio líquido. A diferencia de lo que ocurre en la estirpe silvestre, en el mutante deficiente para el gen foxlnR los genes xy12,xy13,xy14,xyl5 Y xyl6 no aumentan su transcripción en condiciones de inducción. Estos datos indicanqueel productodel gen foxlnR actúa como reguladortranscripcional del complejo xilanolítico. A diferencia de lo que ocurre en especies del género Aspergillus, la sobreexpresión del gen foxlnR no conlleva un aumento de la expresión de los genes xy13, xyl4 Y xyl5 en F. oxysporum sino que por el contrario ésta disminuye aunque su inducción comienza antes. El producto del gen foxlnR ejerce su efecto a través de la unión directa a la secuencia 5'GGCTAA 3' presente en la región promotorade los geneses tructurales,comose ha demostradoen este trabajo en el caso del gen xy14. Se propone un mecanismo de regulación de los genes que integran el complejo xilanolítico que implica la actuación del producto del gen foxlnR, del complejoHapy de la/s proteína/scapaces de reconocer la secuenciacon función represora AGAA. En este trabajo se demuestra por primera vez la implicación de los genes que integran el sistema xilanolítico puesto que la alteración de los niveles del gen foxlnR provoca una alteración del comportamiento patotípico de F. oxysporumf.sp. lycopersici.

Autor: JOVER GIL SARA.
Año: 2004.
Universidad: MIGUEL HERNÁNDEZ DE ELCHE.
Centro de lectura: UNIVERSIDAD MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de realización: UNIVERSIDAD MIGUEL HERNANDEZ.

Resumen: Con el propósito de hacer contribuciones al análisis causal del desarrollo de las hojas de las plantas, hemos obtenido y estudiado varias estirpes mutantes de Arabidopsis thaliana que presentan alteraciones de la morfología foliar, a las que hemos denominado incurvata (icu) y rotunda (ron). El limbo de las hojas vegetativas de los mutantes icu se recurva hacia el haz, en lugar de ser casi plano como el de las estirpes silvestres, lo que sugiere que algún proceso relacionado con la especificación o el mantenimiento de la dorsoventralidad foliar está alterado. Las hojas de los mutantes ron son más anchas y redondeadas que las silvestres, lo que constituye un indicio de la perturbación de la división o la expansión de las células que contribuyen a la organogénesis foliar. Hemos caracterizado genética y molecularmente 9 mutaciones recesivas que pertenecen a los grupos de'complementación ICU8, ICU9 e ICU15, estableciendo mediante clonación posicional que son nuevos alelos hipomorfos o nulos de los genes HYPONASTIC LEA VES1 (HYL 1), ARGONAUTE1 (AGO1) y HUA ENHANCER1 (HEN1), que participan en la ruta de regulación génica postranscripcional mediada por microARN. Nuestros alelos hen1 y hyl1 son presuntamente nulos y causan fenotipos similares a los previamente descritos. Los alelos ag01-51 y ag01-52 son hipomorfos y causan la radialización y la adaxialización parcial o total de algunas hojas vegetativas. Las hojas no radializadas de estos mutantes ag01 muestran una transición entre el peciolo y el limbo mucho más gradual que la que se aprecia en el tipo silvestre. Además, las células epidérmicas de los peciolos de los mutantes ag01-51 y ag01-52 muestran rasgos morfológicos característicos de las del limbo. Estos resultados indican la participación del gen AGO1 en la especificación y/o el mantenimiento de la dorsoventralidad y la proximodistalidad de la hoja. Hemos caracterizado genética y molecularmente dos alelos insercionales, recesivos y probablemente nulos (icu4-3 e icu4-4), y dos puntuales, semidominantes y de ganancia de función (icu4-1 e icu4-2) del gen ICU4, cuyo análisis posicional ha indicado que codifica ATHS-15, un factor de transcripción de la familia Homeodomain/Leucine Zipper 111(HD-Zip 111).Los alelos icu4-3 e icu4-4 no causan fenotipo mutante alguno, lo que sugiere que el gen ICU4 y algún otro miembro de su familia son funcional mente redundantes. Los alelos icu4-1 e icu4-2 son portadores de una mutación en una secuencia complementaria de la de los microARN miR165 y miR166, y causan un incremento en la concentración del ARNm del gen ICU4 que es especialmente patente en las hojas. Los mutantes icu4-1 e icu4-2 presentan curvatura de las hojas vegetativas, retraso de la floración y de la transición entre las hojas juveniles y las adultas, y aberraciones en el desarrollo de la raíz y los tallos, así como una insensibilidad moderada al ABA yal NaCI durante la germinación. Estos resultados indican que ICU4 es regulado negativamente por un microARN y que participa en el desarrollo de la raíz y de los conductos vasculares del tallo, en la función de los meristemos y en el establecimiento de la polaridad foliar. Hemos llevado a cabo análisis globales de la expresión génica en plantas ag01-51/ag01-51 e icu4-1/icu4-1, mediante hibridación en micromatrices validadas por RT-PCR cuantitativa, que nos han permitido identificar genes directa o indirectamente regulados por AGO1 e ICU4. Cabe destacar que entre los genes desregulados en el mutante icu4-1 se cuentan algunos implicados en las respuestas al estrés y en el metabolismo y la señalización de algunas hormonas, entre ellas el ABA. Hemos obtenido dobles mutantes sinérgicos entre varios alelos de los genes AGO1, HEN1, HYL 1, HASTY (HST), e ICU 8 4 que co 4ab nfirman genéticamente la relación funcional que se asume que existe entre los cuatro primeros, que son componentes demostrados o probables de la maquinaria de la ruta de los microARN, así como con ICU4, que es una diana de un microARN. Hemos caracterizado genética y molecularmente dos mutantes ron2, que han resultado ser portadores de nuevos alelos recesivos e hipomorfos del gen LEUNIG (LUG), que codifica un correpresor transcripcional que fue descrito por primera vez por su implicación en el desarrollo de la flor. Nuestros resultados demuestran que RON2 (LUG) está implicado en el control del tamaño y la forma de las hojas, dado que participa en los procesos de expansión celular no polar, posiblemente mediante la regulación transcripcional de genes relacionados con el crecimiento.

Autor: Gómez Mateo Jorge.
Año: 2004.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: Facultad de biología.
Centro de realización: Facultad de Biología.

Resumen: Mucor circinelloides es un hongo filamentoso que presenta una amplia distribución. Pertenece a la clase Zygomycetes, caracterizada por presentar una reproducción sexual por fusión de gametangios, presentar micelios generalmente cenocíticos y producir esporas aflageladas e inmóviles. La luz está imlpicada en la regulación de numerosos procesos metabólicos y de desarrollo en organismos muy diversos. En hongos, la luz está implicada en la regulación de numerosos procesos, los principales estudios sobre control de la expresión génica por la luz se han llevado a cabo en el ascomiceto Neurospora crassa, organismo donde se ha caracterizado este proceso más profundamente a nivel molecular y en los zigomicetos Phycomyces blakesleeanus y Mucor circinelloides. La estirpe silvestre de Mucor circinelloides presenta micelios de color blanco amarillento en la oscuridad, tornándose hacia un color amarillo intenso al ser iluminados, debido a la inducción de la síntesis de b-caroteno. La deleción completa del gen crgA en dicha estirpe elimina el requisito de la luz para la síntesis de carotenos en los micelios conduciendo a una sobreacumulación tanto en condiciones de luz como de oscuridad. El hecho de que el mutante nulo siga respondiendo a la luz indica, sin embargo, que tiene que haber otros genes implicados en la inducción de d la expresión de los genescarotenogénicos por la luz. El objetivo principal de esta tesis fue, por tanto, identificar otros genes implicados en la regulación de la síntesis de carotenos por la luz. Entre los candidatos se considerarán genes homólogos a crgA , abordando también su caracterización y genes homólogos a los genes wc-1 y wc-2 de N. crassa, y su posterior caracterización. Mediante análisis de secuencia se ha demostrado la existencia de una duplicación de la región del genoma de M. circinelloides donde se localiza el gen crgA. En la copia de la duplicación analizada se ha identificado el gen crgB, que cifra una proteína que presenta una estructura de dominios parecida a la de la proteína CrgA. La expresión del gen crgB es reprimida por crgA e inducible por la luz, con un patrón de acumulación de mensajero característico de los genes de respuesta temprana y que incluye la fotoadaptación. En la región promotora del gen crgB se han identificado secuencias repetidas y palindrómicas encontradas en otros genes regulados por la luz de M. circinelloides y que podrían estar implicados en la regulación del gen crgB por la luz. Se realizaron experimentos de interrupción y silenciamiento del gen crgB, que sugirieron que el gen crgB cumple una función esencial en M. circinelloides. Mediante el rastreo de una genoteca genómica de DNA de la estirpe silvestre de Mucor circinelloides con sondas de los genes wc-1 y wc-2, se ha clonado el gen tzf-1 que cifra una proteína con características de factor transcripcional debido a la presencia de dos dominios zinc-finger, y cuya expresión es totalmente dependiente del gen crgA. Mediante amplificación por PCR con cebadores correspondientes a la región conservada de los dominios LOV de fototropinas de plantas, también presente en la proteína WC-1 de Neurospora crassa, se ha clonado un fragmento de cDNA del gen mwc-1a, que cifra una proteína con elevada homología a la proteína cifrada por el gen wc-1 de N. crassa. La expresión del mwc-1a se reprime ligeramente por la luz, siendo el gen crgA necesario para su expresión en la oscuridad. En experimentos de silenciamiento de la expresión del gen mwc-1a se aislaron transformantes incapaces de responder a la luz. El análisis de estos transformantes indica que el gen mwc-1a no está implicado en el control de la carotenogénesis por la luz, así como que algún gen con homología a mwc-1a es responsable de dicho control.

Autor: BURILLO SANZ SERGIO.
Año: 2005.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La capacidad de las cianobacterias de adaptar sus funciones y metabolismo a las cambiantes condiciones ambientales depende de componentes celulares que son en buena parte desconocidos. El objetivo de esta tesis ha sido contribuir al conocimiento de las correspondientes redes de interacción entre elementos implicados en transducción de señales de estrés de nitrógeno, así como establecer interconexiones entre la regulación específica de escasez de nitrógeno y las respuestas globales a situaciones de estrés, entre las cuales la limitación de nitrógeno constituye un inductor eficaz. Para ello se abordó la búsqueda de interacciones entre proteínas de interés (NtcA, NblS, NbIR, NrtC y PII) de Synechococcus sp PCC 7942 y se construyeron y analizaron genotecas para buscar proteínas que interaccinan con PII en el sistema del doble híbrido de levaduras. La N-acetil glutamato quinasa (NAGK) y la proteina que se denominó PipX (de "PII interactin protein X")fueron identificadas por este método. Las interacciones entre PII-NAGK y PII-PipX, ambas novedosas, fueron posteriormente validadas con distintas aproximaciones experimentales que indicaron que la primera de ellas está conservada en organismos que realizan fotosíntesis oxigénica y la segunda en cianobacterias. PipX interacciona también con NtcA, lo que conecta a los dos reguladores principales del metabolismo del nitrógeno en cianobacterias. Los análisis bioinformáticos y de coevolución de las interacciones NblS-SipA, respectivamente cebo y presa en escrutinios de las genotecas construidas en este trabajo, permitieron sugerir la conservación dela correspondiente interacción en cianobacterias.

Autor: Abellán Martínez María.
Año: 2005.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: Facultad de Biología. Universidad de Murcia.
Centro de realización: Facultad de Biología. Universidad de Murcia.

Resumen: El gen carD de Myxococcus xanthus está implicado en la regulación de dos procesos independientes de esta bacteria, la carotenogénesis y el desarrollo multicelular, y también participa en el control de, aproximadamente, el 1% de los genes que se expresan durante el crecimiento vegetativo. Entre ellos se encuentra ddvA, cuya expresión, muy alta en la estirpe silvestre, se anula en fondo mutante carD. Con el objetivo de encontrar nuevos productos génicos relacionados con CarD, se identificaron una serie de mutaciones, denominadas mutaciones sud, que suprimían el efecto de mutaciones carD sobre la expresión de ddvA, no así sobre los procesos de carotenogénesis y de desarrollo multicelular. En este trabajo se han analizado dos de estas mutaciones, la mutación sud-2 y la mutación sud-5, antes de proceder a la clonación de las mismas por complementación fenotípica. El estudio de estirpes portadoras únicamente de las mutaciones sud indicadas y de estirpes portadoras de dichas mutaciones y de la deleción del gen carD muestra que ninguna de estas mutaciones supresoras ejerce per se efecto alguno sobre los procesos de carotenogénesis y de desarrollo multicelular ni sobre la expresión de ddvA, y que son capaces de suprimir el efecto de la deleción de carD sobre la expresión de ddvA con la misma eficacia con la que suprimen el efecto de otras mutaciones carD. El efecto de la mutación sud-5 es contrarrestado por la introducción en el genoma de M. xanthus de un fragmento de DNA de 6984 pb, recuperado de una genoteca de DNA cromosómico de M. xanthus, provocando una complementación aparente. El orf que parece responsable de tal complementación determina una ATPasa de la clase AAA+, aunque no se observa ninguna diferencia en la secuencia de este gen o de su posible promotor entre la estirpe silvestre y la estirpe portadora de la mutación sud-5. Para estudiar la relación existente entre esta mutación supresora y el orf de la ATPasa se han llevado a cabo experimentos de expresión y de sobreexpresión de este último orf que muestran que dicho gen presenta un nivel bajo de expresión y que su promotor no está regulado por CarD ni por sud-5, y que el efecto observado no parece ser una consecuencia del aumento de dosis de la ATPasa. Ensayos de doble híbrido en levadura no han permitido detectar una interacción física entre CarD y la ATPasa, aunque sí de esta última consigo misma, consistente con la estructura oligomérica de las proteínas AAA+. La deleción del gen de la ATPasa no afecta tampoco a la expresión de ddvA, tanto en ausencia como en presencia de una mutación carD, de la mutación sud-5 o de ambas, ni parece tener efecto alguno sobre los procesos de carotenogénesis y de desarrollo multicelular. El efecto supresor de la mutación sud-2, que tras diversos experimentos de transformación, retrocruzamiento y cotransducción parece encontrarse ligada al locus ddvA y a una distancia de 10 kb, queda contrarrestado por la introducción en el genoma de M. xanthus de un fragmento de 4344 pb situado 10 kb aguas arriba de ddvA, provocando una complementación aparente, la cual se observa también con cualquier subfragmento de menor tamaño incluido en el fragmento original. Sin embargo, la secuencia de este tramo de DNA de una estirpe portadora de la mutación sud-2 no presenta diferencias con la secuencia del mismo fragmento de DNA de la estirpe silvestre. Tal complementación aparente se observa también cuando el fragmento de 4344 pb o cualquiera de los subfragmentos probados se integra en un sitio heterólogo del genoma de M. xanthus. Independientemente, se ha llevado a cabo un análisis del locus ddvA. La localización del gen ddvA aguas abajo y acoplado traduccionalmente a un gen que determina un posible factor sigma de la familia ECF, junto con otras observaciones, sugería la posibilidad de que DdvA se tratara de un factor anti-sigma. La generación de fusiones tran 8 scripcio 572 nales al gen lacZ y de estirpes portadoras de deleciones de los dos genes citados ha permitido identificar dos posibles regiones promotoras situadas aguas arriba de los genes indicados, que se encuentran reguladas positivamente por el posible factor sigma y negativamente por DdvA. Ambos promotores se hallan regulados además positivamente por la proteína CarD. Se ha analizado también la dependencia de CarD de dos nuevas posibles parejas de factor sigma ECF-factor anti-sigma de M. xanthus, demostrándose tal dependencia en uno de los casos, por lo que son ya tres los sistemas de factor sigma ECF-factor anti-sigma en M. xanthus regulados por la proteína CarD.

Autor: TÍO BARRERA LAURA.
Año: 2005.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAT BIOLOGÍA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE GENÉTICA - FACULTAD DE BIOLOGÍA - UNIVERSITAT DE BARCELONA.

Resumen: Las metaloproteínas son un grupo de proteínas que se caracterizan principalmente por la presencia de átomos metálicos en su forma funcional. Estos iones metálicos son críticos para una correcta estructura, estabilidad y/o función de las proteínas. Casi un tercio del total de proteínas pueden considerarse metaloproteínas y, dentro de este gran grupo, se incluyen las metaloproteínas (MT). Estas presentan unas características propias que las distinguen del resto de metaloproteínas: * El ion metálico se encuentra siempre coordinado a la proteína mediante enlaces tipo tiol al S de las cisteínas presentes en la cadena polipeptídica (Cys). * Son de pequeño peso molecular (alrededor de 12 kDa). * Tienen precisamente un alto porcentaje de Cys en su composición (aproximadamente un tercio del total de aminoácidos), lo que les confiere su elevada capacidad quelante de metales pesados. En mamíferos se han aislado hasta cuatro genes codificantes de metalotioneínas (isoformas NMTI, MTII, MTIII,MTIV). Estos genes se encuentran todos en una misma región cromosómica, formando el "cluster de metalotioneínas" que se interpreta evolutivamente como el resultado de procesos de duplicación génica. En la especie humana, alguna familia (MTI) presenta todavía un grado superior de duplicidad, con duplicidad de subformas (MTIa, MTIb, ..), de las cuales se desconoce globalmente el significado funcional. En otras especies de mamífero, como el ratón, sólo se ha descrito la existencia de un miembro de cada familia (MTI a MTIV). Existe una gran similitud entre las diferentes isoformas de MT de una misma especie: en ratón las diferencias aminoacídicas van entre 15 aa (MTI-MTII) y 27 aa (MTI-MTIV). Esta similitud se acentúa entre una misma proteína de diferentes especies (entre la MTIV de ratón y la humana hay únicamente 4 substituciones de aa). Contrariamente, existen grandes divergencias en el ámbito de los patrones de expresión de estas isoformas. Mientras MTI y MTII se sintetizan ubicuamente, aunque con predominio en hígado y riñón después de intoxicaciones metálicas, MTIII y MTIV tienen una expresión específica, sintetizándose únicamente en el sistema nervioso y en el epitelio estratificado escamoso, respectivamente. Todas las MT se expresan simultáneamente en tejido decidual. En el grupo de trabajo se habían estudiado previamente las capacidades coordinativas de MTI y MTII, así que dado las diferencias de secuencia y de patrón de expresión que presentaba, se consideró apropiado estudiar también la MT4 y comparar su comportamiento con las anteriores. Dado que las metalotioneínas en aves presentan una inserción amonoacídica en el mismo lugar que MTIV, y teniendo en cuenta que estudios de evolución sitúan a MTIV más próxima a ellas que no MTI, se propuso el estudio de la capacidad coordinativa de ckMT (metalotioneína de pollo) y sus dominios, para comprobar si se asemejaba más al comportamiento de MTV o MTI. El sistema MT de Drosophila melanogaste está formado por 4 isoformas (MTO, MTN, MTC, MTD) de las que se conoce las características coordinativas de las dos primeras. Dado el total desconocimiento sobre las posibles interacciones de las MT's se consideró oportuno un estudio de Two-Hybrid con la MTO y una librería de D.melanogaster adulta. Resumiendo los datos más importantes de los trabajos son: * MT4 tiene preferencia a coordinar metales monovalentes. * ckMT se comporta de manera parecida a la MT12 en presencia de metales divalentes y a la MT4 en presencia de metales monovalentes. * Los iones Cl- y S2- parecen tener un papel importante en la estabilización de algunas MTs y dependiendo del metal que están coordinando. En los experimentos de two hybrid se han obtendio 17 clones positivos que corresponden a: * Tioredoxina peroxidasa: se ha comprobado la interacción por un ensayo GST pull-down. * Hmólog de la guanine nt binding protein. * Vhac39, posteriormente se vio que la secuencia estaba clonada en una posición que no correspondía con su pauta de lectura lo cual generaba una proteína de aa que no corresponde a ninguna hasta ahora descrita. Este resultado se considera negativo.

Autor: LOPEZ PEREZ ANTONIO JOSE.
Año: 2005.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MURCIA.

Resumen: En la Memoria de investigación presentadas se abordan dos objetivos principales: 1,- Desarrollar un protocolo de regeneración de plantas de vid por embriogenesis somática. 2,- Establecer los parámetros básicos para la transformación de células de callo embriogénico mediante cocultivo con agrobacteium tumefaciens. Los resultados obtenidos en el primer objetivo han permitido establecer un protocolo de regeneración de plantas de vid por embriogénesis somática en tres variedades de uva de mesa (crimson seedless, sugraone y don mariano). El tipo de explanto (anteras u ovarios), la adición al medio de cultivo de carbón activo y la morfología de los embriones somáticos diferenciados a partir del callo embriogénico son los tres factores que más han afectado a la eficiencia del protocolo de regeneración. Una vez obtenido callo embriogénico y establecido el protocolo de regeneración, se abordó la transformación de células vegetales mediante agrobacterium en las variedades crimson seedless y sugraone. El establecimiento de un procedimiento de transformación con una alta eficiencia se dividió en tres fases: 1,- Establecimiento de la concentración idónea del antibiótico kanamicina. Los experimentos realizados mostraron que los callos embriogénicos de crimson seedless y sugraone mostraron diferente sensibilidad a la kanamicina. Mientras que en la variedad crimson seedless se inhibió la diferenciación de embriones somáticos con 20 mg/l de kanamicina, en la variedad sugraone fueron necesarios 50 mg/l. 2,- Influencia de la cepa de agrobacterium y la densidad de inoculo. Los estudios de transformación se abordaron con dos cepas de agrobacterium distintas (EHA 105 y C58(pMP90)). Así mismo ambas cepas se utilizaron a distintas densidades de inoculo (DO600 = 0,06 y 0,2). En todos los casos la cepa EHA 105 mostró más eficiencia y se demostró que la densidad de inoculo más eficiente era diferente según la variedad (0,06 en crimson seedles y 0,2 en sugraone). 3,- Efecto del método de cultivo. Los experimentos realizados en esta fase permitieron concluir que el cultivo de callo embriogénico tras la infección y cocultivo con agrobacterium sobre membrana aumentaba la eficiencia del proceso de transformación. El cultivo del callo embrogénico sobre membrana permitió recuperar mayor número de embriones transgénicos y regenerar, finalmente, plantas transgénicas de crimson seedless y sugraone.

Autor: PORTA PELAYO JAVIER.
Año: 2005.
Universidad: MÁLAGA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.

Resumen: S.senegalensis constituye una especie con alto interés económico que se encuentra en las etapas iniciales de su cultivo. Por ello, es necesario contar con herramientas moleculares para estudiar las características genéticas de sus stocks reproductores, así como su evolución en el transcurso de sucesivas generaciones de cultivo. Los objetivos planteados en este trabajo son los siguientes: 1,- Obtención demarcadores microsatélites para la especie S.senegalensis. 2,- Valorar estas herramientas para la caracterización genética del stock reproductor de una empresa del sector. 3,- Estudiar la variabilidad genética de distintos stocks reproductores con distinto comportamiento reproductivo. 4,- Redistribución del stock reproductor de una empresa del sector en cinco tanques de puesta mediante estimadores de parentesco, para así optimizar los recursos del stock. 5,- Desarrollo de una herramienta automática de PCR múltiple para su aplicación al estudio del pedigrí en esta especie. Los resultados y conclusiones se presentan a continuación. 1,- Se han aislado 15 loci microsatélite de la especie Solea senegalensis y otros 3 adaptados de Solea solea para el estudio de s.senegalensis, los cuales representan una herramienta muy útil para el estudio genético de poblaciones naturales y cultivadas. 2,- El conjunto formado pro los 5 loci: AF441385, AF441387, AF441389, AF41390 y AYA426693 ha mostrado características adecuadas para llevar a cabo análisis genéticos de pdigrí bajo condiciones de cultivo. 3,- Los estudios de pedigrí realizados a lo largo de un periodo de puesta en una empresa, revelan que una sola hembra y dos machos han sido responsables de más de un millón de descendientes, lo que da una idea de la alta capacidad reproductiva de esta especie. 4,- El conjunto formado por los 8 loci: AF441385, AF441387, AF441388, AF441389, AF441390, AY426692, AY426693 y AF173849, han probado ser útiles en la caracterización genética de grupos tanto de origen cultivado como salvajes. Además ha demostrado su utilidad en la estimación de los valores de parentesco en ausencia de datos de genealogías. 5,- El análisis genético de varios grupos de individuos reproductores capturados en la Bahía de Cádiz indican ser muestras representativas de una población salvajes homogénea. La caracterización genética de esta población mediante 8 loci, revela valores de variabilidad genética altos, con un número medio de alelos por locus de 15.1 y una hetrocigosidad esperada de 0,84. Estos valores se hallan en el rango de los descritos en diversas especies marinas. 6,- El análisis genético de grupos de individuos nacidos en cautividad y usados como reproductores en varias instalaciones dedicadas al cultivo de S.senegalensis muestran unos valores de variabilidad genética muy inferiores a los mostrados por individuos del medio natural. Esta drástica reducción de los niveles de variabilidad, se debe a la incorporación al stock de reproductores de un alto número de individuos con estrechas relaciones de parentesco. 7,- El empleo generalizado de individuos nacidos en cautividad, los fuertes efectos de selección y deriva genética provocados por las condiciones artificiales de cultivo, el desconocimiento de las relaciones de parentesco entre los individuos, la elevada capacidad reproductiva y el trafico de animales entre instalaciones, han producido un importante deterioro de la variación genética en gran parte de los stock reproductores empleados tanto en la explotación como en la investigación de esta especie. 8,- La importante perdida de variación genética de estos stock de origen cultivado pueden estar afectando negativamente a la capacidad adaptativa de estos grupos. Además, la inclusión en stock reproductores de un elevado número de individuos, procedentes de fuertes cuellos de botella, puede ocasionar un aumento considerable dela consanguinidad en las próximas generaciones provoca 8 ndo efec 59b tos adversos derivados de la homocigosis y en consecuencia sentando bases inadecuadas para el futuro del cultivo de esta especie. 9,- El uso de estas herramientas genéticas permite resolver muchas dudas del cultivo de esta especie, como en su comportamiento reproductivo. Dicho conocimiento nos permitiría ejercer un exhaustivo control de la reproducción y en consecuencia hacer una selección adecuada de los individuos que se emplean como reproductores, de forma que se garantice la conservación de los recursos genéticos existentes. 10,- Se ha desarrollado una herramienta automatizada para el análisis de 5 loci microsatélite mediante la metodología de PCR múltiple. Este método reduce el tiempo y coste de la técnica, minimizando la manipulación, y por tanto, el riesgo de errores de manejo. Para realizar estos análisis tan solo es necesario una pequeña cantidad de ADN obtenida por métodos no invasivos. Además, la estandarización de los loci empleados permite comparar resultados procedentes de distintos laboratorios.

Autor: RELAT PARDO JOANA.
Año: 2006.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA - UNIVERSITAT DE BARCELONA.

Resumen: El aumento de triglicéridos y acil-CoAs puede darse en casos de obesidad o hipersecreción de insulina y su acumulación en tejidos periféricos como músculo o páncreas puede afectar a la captación de glucosa y a la funcionalidad de las células beta, respectivamente. El control de los niveles de ácidos grasos en etapas precoces de la obesidad y la diabetes tipo2 permitirían, según esto, reducir la hiperinsulinemia y la resistencia a insulina asociadas y evitar la lipotoxicidad provocada por la acumulación de grasas son metabolizados es la beta-oxidación mitocondrial. Se trata de un proceso finamente regulado que presenta su punto crítico en la entrada de los ácidos grasos a la matriz mitocondrial. Debido a su hidrofobicidad, los ácidos grasos de cadena larga son incapaces de atravesar la membrana mitocondrial y requieren de un sistema lanzadera, el sistema carnitina palmitoiitransferasa. Este sistema está formado por tres enzimas que catalizan la translocación de los ácidos grasos de cadena larga a través de un mecanismos dependiente de carnitina. Se trata de un sistema regulado sobre todo a través de la enzima carnitina palmitoiitransferasa1 (CPT1) que cataliza la formación de tioésteres de los acils-CoA de los ácidos grasos de cadena larga con carnitina, generando acilcarnitinas en la membrana mitocondrial externa. La CPT1 es una proteína controlada nivel transcripcional y a nivel alostérico a través de su inhibidor fisiológico, malonil-CoA. Para estudiar los mecanismos de regulación transcripcional de la CPT1B se utilizaron 380 bp de la región promotora de la CPT1B humana donde ya habían sido caracterizados un elemento de respuesta a receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR), un elemento de respuesta a factores miogénicos de la familia MyoD. Los resultados obtenidos de experimentos de transfección transitoria describen un mecanismo sinérgico y cooperativo entre PPARalfa y MEF-2c en la expresión de la CPT1D humana, así como un efecto ransactivador diferencial entre PPARalfa y PPARdelta sobre el promotor estudiado. Paralelamente se ha descrito la participación de un elemento G/C de respuesta a factores de la familia Sp en la actividad basal del promotor estudiado. Paralelamente se ha descrito la participación de un elemento G/Cde respuesta a factores dela familia Sp en la actividad basal del promotor y en la transactivación del gen por PPARalfa, a través de la unión del factor de transcripción Sp1 al DNA. A parte delas interacciones funcionales descritas, se han descrito interacciones físicas in vitro entre PPARalfa y MEF-2C y entre PPARalfa y Sp1. En el estudio de la regulación de la actividad enzimática de la CPT1 se ha clonado y caracterizado la enzima CPT1B de cerdo y se han generado proteínas quiméricas entre la CPT1A de rata y la CPT1A de cerdo, con el objetivo de localizar regiones de la proteína importantes en la definición de las constantes cinéticas de estas enzimas, especialmente aquellas que puedas influir en la sensibilidad al malonil-CoA de la proteína. De los resultados obtenidos se deduce que la CPT1B de cerdo presenta características cinéticas próximas a un isotipo A, a pesar de tener una elevada identidad aminoacídica con los isotipos B y que las quimeras entre CPT1A de rata y CPT1A de cerdo confirman la existencia de un dominante positivo y una dominante negativo en la región N-terminal de los isotipo A de la CPT1. También se concluye que la región C-terminal de las CPT1 se comporta como un único dominio funcional. Finalmente, el trabajo describe un mecanismo independiente de malonil-CoA en la activación del sistema CPT por el compuesto sintético C75.

Autor: TÉLLEZ BESOLI NOÈLIA.
Año: 2006.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El transplante de islotes pancreáticos es una terapia emergente para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 1. Estudios previos de nuestro grupo han mostrado que durante los primeros días después del transplante de islotes, cuando existe una pérdida de más de 60% de la masa inicialmente trasplantada, existe un aumento de la expresión de IL-1. El antagonista del receptor de interleuquina 1 (IL-1Ra) es un antagonista natural que compite con la IL-1 para interaccionar con el receptor tipo 1 pero no inicia la transducción de la señal. La hipótesis en la que se ha basado este trabajo es que la citoquina proinflamatoria, IL-1, está implicada en el fallo del transplante. Designando la sobreexpresión de IL-1Ra como la estrategia a seguir para mejorar el pronóstico del trasplante singénico de islotes pancreáticos. Así pues, el objetivo general del estudio es determinar si la sobreexpresión de IL-1Ra en los islotes pancréaticos protege a las células beta de los efectos deletéreos de IL-1 sobre los islotes en cultivo y mejora el pronóstico del transplante. Para todo el estudio se utilizaron islotes de ratas Lewis que se infectaron con 6.26 x 106 pfu de adenovirus que codificaba por el gen dela proteína verde fluorescente (Ad-GFP), por el de la beta-galactosidasa (Ad-LacZ) o bien por el del atagonista del receptor de IL-1 (Ad-IL-1Ra). 48h después de la infección el 100% de los islotes estaban infectados y un 30% de las célula sinsulars expresan el transgén. Los islotes se expusieron a 50U/ml de IL-1beta durante 48h, después de este tiempo fueron incluidos en parafina y procesados para inmunohistoquímica. La exposición de los islotes de la citocina proinflamatoria IL-1 provocó un incremento de la apoptosis una inhibición de la replicación de las células beta que fueron revertidos por la sobreexpresión de IL-1Ra. Posteriormente, grupos de 500 islotes no infectados o infectados con Adl-lL-1Ra fueron trasplantados bajo la cápsula rental de ratas Lewis diabéticas por inyección simple de estreptozotocina. Los injertos de islotes se recuperaron después de 3, 10 ó 28 días del trasplante y fueron procesados para inmunohistoquímica. Los injertos de islotes que sobreexpresaban IL-1Ra presentaban unos niveles de apoptosis (determinada pro la técnica del TUNEL) de las células beta, más bajos que los injertos control a todos los tiempos estudiados. La replicación de las células beta (Determinada por incorporación de BrdU) solamente estaba estimulada en los injertos del día 10, aunque los islotes se encontraran bajo condiciones de hiperglicemia dónde se espera una estimulación la replicación delas células beta. En cambio, los injertos de islotes que sobreexpresaban IL-1Ra presentaban unos niveles de proliferación de las células beta estimulados respecto lo que se encuentran en un páncreas normal. Finalmente, la sobreexpresión de IL-1Ra permitió la recuperación de la masa de células beta (determinada por morfometría) perdida durante los primeros días después del trasplante de islotes. Los efectos positivos de la sobreexpresión de IL-1Ra sobre la viabilidad, proliferación y masa de las células beta se tradujeron en un mejor pronóstico del trasplante de islotes, ya que el 100% de los animales trasplantados con 800 islotes que sobreexpresaban IL-1Ra recuperaron la normoglicemia a los 14 días después del trasplante, en cambio sólo un 40% de los trasplantados con islotes control revirtieron la diabetes. A partir de estos resutlados concluimos que la IL-1 está implicada en el fallo del trasplante y debe jugar un papel central, debido que sólo el bloque de su acicón mejora claramente el pronóstico del trasplante.