ANTIBIOTICOS

Autor: OTEO IGLESIAS JESUS.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID [www.ucm.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE MICROBIOLOGIA.

Resumen: La resistencia a antibióticos en algunos de los princiaples patógenos bacterianos en humanos es un importante problema de Salud Pública reconocido en todo el mundo. España es uno de los países occidentales que más se ve afectado por esta problemática. La Unión Europea (UE) estableció en 1998 el proyecto "European Antimicrobial Resistance Surveillance System" para la vigilancia de la resistencia a antibióticos de aislamientos de sangre y líquido cefalorraquídeo de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y enterococos en Europa. España participa en esta red oficial europea desde 2000, aportando información de las cepas aisladoas por un grupo de 38 hospitales (media anual de participación), distribuidos de forma representativa por toda España, que dan cobertura asistencial aproximadamente a 11.000.000 de personas (28% de la población española). El consumo de antibióticos es el primer factor que condiciona la aparición de la resistencia. En Europa, el consumo de antibióticos se somete a vigilancia mediante el "European Surveillance of Antimicrobial Consumption". En esta tesis se analizan los datos de resistencia a antibióticos obtenidos por la red EARRSS-España entre 2001-2003, sus perfiles fenotípicos y la evolución en el tiempo. Además, se realiza un estuido de la correlación entre el consumo y la resistencia a antibióticos, y un estudio comparativo de la resistencia a antibióticos en los distintos países europeos.

Autor: GONZÁLEZ CABEZA JOSE GUILLERMO.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: Dada la importancia clínica de las quinolonas en el el control de enfermedades infecciosas y las posibles implicaciones que puede tener el hecho de que estas moléculas sean agentes mutagénicos en bacteriasl, el presente estudio se ha centrado en profundizar en los mecanismos de mutagénesis, utilizando la ciprofloxacina como molécula modelo, y en determinar el potencial mutagénico de quinolonas de actual uso clínico. En lo que se refiere a los mecanismos de mutagénesis, se ha demostrado que para la mutagénesis inducida por ciprofloxacina, se requiere que las bacterias posean un sistema de reparación de escisión de nucleótidos (NER) funcional, descartándose que el operón moa, el cula codifica genes de biosíntesis de cofactores de molibdeno tenga algún papel en dicha mutagénesis. Estos resultados corroboran estudios anteriores, los cuales sugerían la participación del sistema NER en dicha mutagénesis, e indican que probablemente otros genes deleccionados en las cepas de ensayo de S.enterica Typhimurium TA104 y TA2659 distintos del uvrB, no deben tener un papel importante en la mutagénesis mediada por las quinolonas. Por otra parte, se ha demostrado que la cicprofloxacina puede generar alguna especie reactiva de oxígeno, probablemente el anión superóxido (O2-) y/o oxígeno singlete produciendo daño oxidativo, el cual no debe de ser preferentemente la lesión 8-oxoG. El conjunto de estos resultados indica que las quinolonas deben de producir diferentes tipos de lesiones en el DNA de las células bacterianas. Así, la interacción de la molécula de quinolona con el complejo DNA-DNA girasa debe generar un tipo de distorisión análoga a un enlace intercatenario, dando lugar a una lesión premutagénica. Dicha lesión puede ser procesada por el sistema NER y convertirse en una lesión mutagénica sobre la cual actuaría una DNA polimerasa tendente al error, análoga a MucAB y que introduciríra una mutación. Este mecanismo de mutagénesis debe ser común a este tipo de moléculas. Por otra parte, los resultados obtenidos en mutantes soxRS indican que esta familia de compuestos también introducen lesiones oxidativas, las cuales deben de ser más relevantes en aquellas moléculas descritas como fototóxicas, como clinafloxacina, lomefloxacina y otras. Finalmente, y utilizando ensayos de retromtuación en E.coli y S.enterica Typhimurium, se ha demostrado que las quinolona se cuarta generación clinafloxacina, trovafloxacina y gemifloxacina son las que presentan mayor actividad mutagénica, mientras que levofloxacina y moxifloxacina son las que producen un menor número de revertientes en ambos sistemas de ensayo. El potencial mutagénico de cada quinolona debe de estar relacionado con su estructura molecular, permeabilidad de la bacteria y acumulación de las quinolonas. Así, se relaicona la baja capacidad de mutagénesis de la moxifloxacina en ambos ensayos con la presencia de un grupo metoxi en posición C-8, mientras que la ciprofloxacina es detectada como una molécula de elevada capacidad mutagénica en E.coli WP2/pKM101 y de baja actividad en S.enterica Serov. Typhimurium. Es de señalar que la mutagénesis estudiada se manifiesta a dosis de quinolonas inferiores a la CMI de cada molécula en las cepas de ensayo. En atención a estos resultados se discute las posibles implicaciones de la exposición de las problaciones de patógenos a bajas dosis de quinolonas y se propone este tipo de estudio como calves para el desarrollo de nuevas moléculas de esta familia de antimicrobianos, los cuales deberían presentar una mejor actividad antibacteriana junto a una baja capacidad de introducir mutaciones.

Autor: VIZCAINO GONZALEZ JUAN ANTONIO.
Año: 2004.
Universidad: SALAMANCA [www.usal.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SALAMANCA.

Resumen: Esta Tesis Doctoral contiene cuatro capítulos independientes. I. Estudio de la actividad antibiótica de cepas de Trichoderma. Se llevó a cabo un estudio de la actividad antibiótica de 24 cepas de distintas especies de Trichoderma sobre un panel de 20 microorganismos diana. Se encontró una gran variación entre las actividades detectadas, no existiendo una correlación clara entre una determinada especie de Trichoderma y el patrón de antibióticos que producía. II. Identificación de peptaiboles, clonación y caracterización de dos péptido sintetasas de T. harzianum. En primer lugar, se identificaron los peptaiboles que producían diferentes especies de Trichoderma. Después, usando diferentes estrategias, se llevó a cabo la clonación parcial de los genes salps1 y salps2 en la cepa T. harzianum CECT 2413, que codifican sendas péptido sintetasas. salps1 parece ser un pseudogen. Mediante un exhaustivo análisis de la secuencia, se formulan hipótesis sobre la posible función de estos genes. III. Clonación y caracterización del gen ThPTR2 de T. harzianum. Utilizando una estrategia basada en la generación de ESTs, se identificó, clonó y caracterizó el gen ThPTR2 de la cepa T. harzianum CECT 2413, que codifica un transportador de oligopéptidos de la familia PTR. Se realizó tanto una sobreexpresión homóloga como heteróloga del gen y los ensayos de actividad confirmaron la actividad prevista. Es el primer transportador de este tipo que ha sido estudiado en hongos filamentosos. IV. Clonación y caracterización del gen chit101 de T. atroviride. Usando la misma estrategia anterior, se identificó, clonó y caracterizó el gen chit101 de la cepa T. atroviride T11. chit101 codifica la primera quitinasa de tipo "vegetal" estudiada en Trichoderma. Se realizó sobreexpresión homóloga del gen y se realizaron ensayos de actividad quitinasa, que confirmaron esta actividad.

Autor: MILLÁN LAPLANA LETICIA.
Año: 2004.
Universidad: ZARAGOZA [www.unizar.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El objetivo general de este trabajo fue analizar el estado de la epidemiología molecular de los determinantes genéticos de resistencia a antibióticos MLS en cepas de Staphylococcus aureus y de especies de estafilocococs coagulasa-negativos (SCN) aisladas en el Servicio de Microbiología del Hospital Clínico Universitario "Lozano Blesa" de Zaragoza, así como su estructura y regulación, y completando con el estudio de su diseminación. Así mismo, basándonos en los fenotipos de resistencia a distintos antibióticos, tratar de caracterizar algunos de los genes responsables de estas resistencias y también su diseminación. En las cepas de estafilococos resistentes a eritromicina estudiadas, predominó el fenotipo MLSB constitutivo sobre los fenotipos inducible y MS. Se encontró una alta tasa de cepas multi-resistentes, lo que muestra la eficiente diseminación de genes de resistencia, siendo mayor en SCN que en S. aureus, lo que sugiere la actuación de los primeros como reservorio de estos genes. Dicha multi-resistencia no afectó, sin embargo, a vancomicina y linezolid, que mostraron una excelente actividad in vitro. Se encontró una buena correlación entre la determinación de la resistencia a oxacilina mediante dilución en agar y la detección de mecA, observándose grandes discrepancias con la técnica de difusión con disco, lo que lleva a recomendar la utilización de varios métodos simultáneamente para detectar dicha resistencia. El gen erm(C) prevaleció respecto a erm(A) tanto en S. aureus como en SCN, no detectándose mef(A) ni erm(A) subclase erm(TR) en ninguna cepa. Se observó un aumento en la prevalencia de erm(B) en cepas clínicas de estafilococos, lo que sugiere una propagación horizontal de este gen desde enterococos, neumococos y/o estafilococos que compartan nicho ecológico, y una diseminación clonal de estafilococos portadores del mismo. Se encontraron combinaciones de varios genes erm y de éstos con msr(A), prevaleciendo este último en SCN. Paradójicamente, en algunos de estos aislamientos se expresaba sólo el segundo, ya que el fenotipo era MS. Por ello, aunque el fenotipo de resistencia permite deducir el genotipo, es necesario estudiar los determinantes presentes dada la posible combinación de los mismos. Del mismo modo, el conocimiento del genotipo hace necesario el estudio de la expresión fenotípica. Se encontraron delecciones de 58 y 107 pb en la región reguladora de erm(C), y delecciones de 10 (descrita por primera vez) y 121 pb en la de erm(A) que explican la expresión constitutiva de ambos genes. Se detectaron los genes aac(6')/aph(2''), ant(4')-Ia, aph(3')-IIIa y ant(6) como responsables de la resistencia a aminoglicósidos, mientras que la no detección de algunos de ellos en cepas resistentes sugería la presencia de otros mecanismos de resistencia. Se confirmó en algunas cepas de S. aureus y SCN la presencia de ant(6)-sat4-aph(3')-IIIa conformando un grupo ("cluster") cuyo vector es Tn5405, demostrando que ya hay genes para un antibiótico nunca utilizado en España: la estreptotricina. Se detectaron los genes tet(K) y tet(M) de resistencia a tetraciclina. La presencia de intTn en dos S. aureus portadores de tet(M) sugiere la presencia de Tn916 o similares. Se confirmó la presencia de Tn554 en S. aureus portadores de erm(A) y la transferencia conjugativa de erm(A), erm(B), erm(C), msr(A), ant(4')-Ia, aph(3')-IIIa y aac(6')/aph(2''). La localización de muchos de ellos en elementos no conjugativos sugiere que su transferencia está mediada por transposones y/o plásmidos conjugativos que los movilicen. Se identificaron 6 tipos estructurales de SCCmec en S. aureus y 16 en SCN, de los cuales 14 se describen por primera vez. La tipificación mediante PFGE mostró gran homogeneidad entre las cepas de S. aureus y S. haemolyticus, lo que indica la diseminación clonal de cepas resistentes, contrastando con la gran heterogeneidad de S. epidermidis y S. hominis, que confirma la diseminac 8 ión hori 29d zontal de genes de resistencia.

Autor: BRIÑAS HERCE LAURA.
Año: 2005.
Universidad: LA RIOJA [www.unirioja.es].
Centro de lectura: UNIVERSIDAD DE LA RIOJA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE LA RIOJA.

Resumen: Se han caracterizado el tipo y la variante de los genes codificantes de las enzimas beta-lactamasas en una serie de cepas de E. coli comensales y clínicas de animales y humanos y en cepas aisladas de muestras alimentarias en diferentes periodos de tiempo comprendidos entre los años 1997 y 2003. Se ha estudiado la evolución temporal de las beta-lactamasas de espectro extendido (BLEEs), la relación clonal entre las cepas productoras de BLEEs, el entorno de los genes codificantes de BLEEs de la familia CTX-M así como la presencia de integrones en las cepas que presentan estos genes. Entre las cepas de E. coli estudiadas se han identificado tres mecanismos responsables de la resistencia a cefalosporinas de amplio espectro: i) la hiperproducción de la beta-lactamasa cromosómica AmpC, por presencia de mutaciones en las posiciones -42 o -32 del promotor del gen; ii) la producción de la cefalosporinasa plasmídica CMY-2; y iii) la producción de BLEEs, principalmente de la familia CTX-M. Se ha detectado un aumento con el tiempo del número de cepas de E. coli, comensales y clínicas de origen animal, productoras de BLEEs y una mayor diversidad de estas BLEEs. Se ha observado asimismo un aumento de las BLEEs de la familia CTX-M, entre las que se identificaron CTX-M-14, como mayoritaria, CTX-M-9, CTX-M-1 y CTX-M-32. Se ha observado una gran diversidad clonal entre las cepas de E. coli, de origen animal o humano, productoras de BLEEs o cefalosporinasas plasmídicas lo que sugiere que la diseminación de los genes de estas beta-lactamasas puede ser debida a una transferencia horizontal y no a la diseminación de un clon. Se ha observado que ninguna de las cepas de E. coli estudiadas portadoras de genes codificantes de BLEEs o de la cefalosporinasa plasmídica CMY-2, presentaba mutaciones en las posiciones -42 o -32 del promotor de ampC, relacionadas con la hiperproducción de la beta-lactamasa cromosómica. El gen de la beta-lactamasa CTX-M-9 aparece en todos los casos incluido en el integrón In60, aunque se han observado variaciones en cuanto a la organización y composición de dicho integrón. Se han detectado cambios en la región variable y se ha identificado la secuencia de inserción IS1 detrás del gen. Por otro lado la mayoría de los genes de la b-lactamasa CTX-M-14 se encontraban flanqueados por las secuencias de inserción ISEcp1 e IS903, aunque, en tres cepas se identificó este gen incluido en el integrón In60. Los genes de las beta-lactamasas CTX-M-1 y CTX-M-32 presentaban el mismo entorno genético, en el que se detectó la secuencia ISEcp1 delante y el orf1 detrás del gen. El 75% de las cepas que contenían genes de beta-lactamasas tipo CTX-M, presentaban integrones de tipo 1 o 2. Entre los integrones de tipo 1 se encontraron seis combinaciones de genes casete diferentes mientras que entre los de tipo 2 sólo se identificó una única combinación de genes casete. La mayoría de estos integrones contiene genes que confieren resistencia a antibióticos no beta-lactámicos como trimetoprim, estreptomicina o sulfamidas. El 28% de las cepas con genes de tipo CTX-M presentaban el gen incluido en el integrón, aunque en ningún caso como gen casete. Una de las cepas que contenía el gen de la beta-lactamasa CTX-M-32 presentaba un in 8 tegrón d 4ba e tipo 1 que incluía un gen casete no relacionado con la resistencia a antibióticos sino con funciones de transducción de señales. La microbiota intestinal de animales sanos constituye un reservorio de genes de resistencia a antibióticos beta-lactámicos, pudiendo dichos genes de resistencia ser transferidos a otros microorganismos de la microbiota intestinal y a microorganismos patógenos. El empleo de antibióticos no beta-lactámicos como trimetoprim, estreptomicina o sulfamidas puede ser un factor de selección de bacterias E. coli con genes de BLEEs de tipo CTX-M.

Autor: RODRÍGUEZ MARTÍNEZ JOSÉ MANUEL.
Año: 2005.
Universidad: SEVILLA [www.us.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: En 1998, se describió por primera vez resistencia a quinolonas transmisible horizontalmente mediante un plásmido conjugativo. La diseminación horizontal de mecanismos de resistencia a fluoroquinolonas abre la posibilidad de una rápida expansión de la resistencia a estos antimicrobianos, tanto en patógenos de animales como humanos, más aún con el extenso uso que se hace de las mismas. El trabajo de investigación recogido en la presente Tesis Doctoral ha permitido obtener información de interés sobre dos aspectos fundamentales que rodean a este fenómeno: 1,- La diseminación horizontal de mecanismos de resistencia a fluroquinolonas es una vía eficaz para la rápida expansión de la resistencia este grupo de antimicrobianos. 2,- La disminución de sensibilidad a quinolonas mediada por genes qnr compromete la detección de resistencia mediante sistemas automatizados y conduce a fracaso terapéutico.

Autor: FENOSA BERNADÓ ANNA.
Año: 2005.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA, UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: El objetivo principal de la tesis fue estudiar los mecanismos implicados en la resistencia a las fluoroquinolonas en cepas clínicas del género Klebsiella, centrando los estudios en los mecanismos de reflujo. Los mecanismos que confieren resistencia a las bacterias para un determinado antibiótico pueden ser distintos. Desde la inactivación enzimática del antibiótico, la modificación de la diana y mecanismos más generales como la disminución de la permeabilidad de la membrana y la expresión de bombas de reflujo. Las bombas de reflujo son translocasas que se sitúan en la membrana citiplasmática con capacidad de expulsar fuera de la bacteria una gran variedad de sustancias mediante la fuerza protón-motriz, por lo tanto no requieren la hidrólisis de ATP. En lo que se refiere a las bombas de reflujo en bacterias Gram negativs se ha visto que en E.coli. El operón acrAB, codifica por una bomba de reflujo pero no codifica para ninguna proteína de membrana externa (OMP), se ha descrito que es la proteína TolC, la que actúa como canal de membrana externa. En el caso de Klebsiella se conoce un sistema de reflujo AcrAB com el de E.coli , y en los estudios realizados se puso de manifiesto la presencia de esta bomba de reflujo en las cepas clínicas estudiadas y su implicación en la resistencia a fluoroquinolonas mediante medidas de acumulación de cicprofloxacina, efectos del antibiótico sobre el crecimiento y curvas de muerte. No se conoce cual es proteína de canal de la membrana externa que está asociada a la bomba de reflujo AcrAB en Klebsiella. La búsqueda de esta proteína asociada a la bomba de reflujo fue el objetivo principal de esta tesis doctoral. Se puso de manifiesto la presencia de la proteína TolC en una cepa clínica de Klebsiella oxytoca, de la cual se determinó su secuencia y se comparó con la de otras entrobacterias obteniendo un elevado percentatge de identitat, especialmente con la proteïna TolC de E.aerogenes. Una vez conocida la secuencia de la proteína TolC de K.oxytoca se realizó una aproximación al modelo estructural de la proteína TolC de K.oxytoca obteniendo una estructura muy similar a la descrita en E.coli. La diferencia más destacable se observó en las cadenas que se extienden hacia el exterior de la bacteria, estas estructuras tiene como función ser receptoras de bacteriocinas y fagos, donde TolC de K.oxytoca presentaba una menor longitud. En el estudio de sensibilidad a colicinas se observó la resistencia a colicina E1 de la cepa clínica de K.oxytoca, por lo que la menor longitud de les cadenas exteriores modifica su función com a receptor de colicinas. Estudios fisiológicos realizados en la proteína TolC de K.oxytoca demostraron que esta proteína forma canales transmembrana en bicapas lípidicas artificiales con una conductancia aproximada de 80 pS en LC1 1M y que presenta una fuerte selectividad catiónica.

Autor: GALLARDO MONTILLA FRANCISCO.
Año: 2005.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAT DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAT DE FARMÀCIA - UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: Los objetivos perseguidos con la realización de este trabajo fueron: 1,- Analizar la evolución de la resistencia a diferentes agentes antimicrobianos en aislamientos clínicos de Salmonella, Campylobacter y Aeromonas y comparar los niveles de resistencia a diversos agentes antimicrobianos en aislamientos clínicos procedentes de diarrea en nuestra área goegráfica y de diarrea del viajero. 2,- Estudio de las bases moleculares de los mecanismos de resistencia a ampicilina, aminoglucósidos, cloramfenicol, trimetoprim y quinolonas en aislamientos clínicos de Salmonella typhimurium. 3,- Investigar los mecanismos de resistencia a quinolonas en aislamientos clínicos de Campylobacter jejuni y Aeromanas spp. Las conclusiones a las que se llegó: 1,- En los últimos años ha habido un incremento significativo en los niveles de resistencia a los antibióticos usados en la práctica clínica por parte de Salmonella enterica serotipo Typhimurium, Campylobacter spp., y Aeromonas spp. Este incremento se observa tanto en aislamientos de pacientes de nuestra área geográfica como aquellos con diarrea del viajero. 2,- El incremento de resistencia a ampicillina en Salmonella enterica serotipo Typhimurium tiene lugar fundamentalmente por síntesis de beta-lactamasas tipo TEM y CARB y en menor medida las b-lactamasas tipo OXA. 3,- La dihidrofolato reductasa la está ampliamente distribuida en Salmonella enterica serotipo Typhimurium y es el principal mecanismo de resistencia a trimetoprim en dicho microorganismo. 4,- Además de la expresión de la cloranfenicol acetil transferasa, debe existir otro mecanismo de resistencia a cloranfenicol en Salmonella enterica serotipo Typhimurium. 5,- Cepas de Salmonella enterica serotipo Typhimurium pertenecientes al mismo clon poseen diferente susceptibilidad antibiótica lo que sugiere una evolución divergente asociada con la adquisición de elementos genéticos móviles que contienen determinantes de resistencia a los antibióticos. 6,- Aeromonas veronii biotipo sobria es la especie del género Aeromonas más frecuentemente encontrada como causa de diarrea del viajero. 7,- Los síntomas que definen una enteritis por Aeromonas son diarrea acuosa y persistente, fiebre y dolor abdominal. 8,- En los géneros Campylobacter y Aeromonas, se observa un incremento en la resistencia a quinolonas, atribuidos a la presencia de mutaciones en los genes gyrA (en las dos especies) y par C (en Aeromonas). 9,- Alteraciones puntuales en el gen gyrA de campylobacter spp, dan lugar a un incremento significativo de los valores de las MIC a quinolonas a diferencia de otros microorganismos que necesitan mutaciones adicionales en otros genes como puede ser el parC. 10,- Las diferencias observadas en las MIC a quinolonas en el género Aeromonas se puede deber a la sobreexpresión de sistemas de expulsión activa del antibiótico.

Autor: AL WARAGLI NADA.
Año: 2005.
Universidad: CÓRDOBA [www.uco.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Hoy en día, desde el punto de vista clínico, las micobacterias tanto típicas como atípicas producen graves cuadros patológicos. En enfermedades antiguas como la tuberculosis y otras recientes como las micobacteriosis. Las manifestaciones clínicas dependen en gran medida del estado inmunológico de la persona afectada. La micobacteriosis es una de las complicaciones más frecuentes del SIDA, y la tuberculosis es la única infección oportunista de los enfermos VIH con una extraordinaria facilidad de contagio. De hecho, ha existido un incremento del número de enfermos con tuberculosis, y existe el gran problema de la resistencia, complicándose en una resistencia múltiple. De ahí la necesidad de investigar nuevos enfoques quimioterápicos. El objetivo de nuestro estudio pues, es estudiar la actividad y la posible eficacia clínica de dos nuevas fluorquinolonas moxifloxacina y levofloxacina de cuarta y tercera generación respectivamente. Para ello se determina la concentración mínima inhibitoria mediante el sistema informatizado ESP, y se calculan los valores de la CMI90, la CMI50, y el CRI (el cociente relativo de inhibición). Además, se realiza un estudio comparativo de la actividad de estas dos drogas con ofloxacina y ciprofloxacina ya utilizadas en el tratamiento de infecciones por micobacterias. Las cinco especies de micobacterias de interés clínico objeto de este estudio son: M.tuberculosis, M.bovis, M.avium, M.fortuitum, y M.chelonae. La moxifloxacina muestra tener la mejor actividad in vitro y la mayor eficacia clínica. A su vez la levofloxacina muestra ser más activa que su D-isómero ofloxacina.

Autor: VALVERDE ROMERO EMILIO DAVID.
Año: 2005.
Universidad: SALAMANCA [www.usal.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En el laboratorio de Microbiología del Hospital Universitario de Salamanca, se recogieron las cepas de E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca y Salmonella enterica que presentaban una sensibilidad disminuida a cefalosporinas de tercera generación y/o aztreonam y que presentaron positivas las pruebas de sinergismo con ácido clavulánico. Se realizó isoelectroenfoque para determinar el punto isoeléctrico de cada betalactamasa y se demostró la capacidad de conjugación de la misma desde una cepa donadora a otra receptora, por el metodo de filtración por membrana. Se amplificaron los correspondientes genes codificantes de cada tipo de BLEE o qnr, que fueron identificados con la reacción de secuenciación. Para el análisis epidemiológico de las cepas, se realizó un RAPD. En los casos en que éste no discriminaba entre las cepas se realizó una PFGE. Las cepas obtenidas se distribuían: Klebsiella pneumoniae (33 cepas), Klebsiella oxytoca (4 cepas), Escherichia coli (114 cepas) y Salmonella enterica (5 cepas).Las 156 cepas representan una incidencia global del 1,1%. Los patrones de BLEE encontrados en las cepas consistían, en la mayoría de los casos, en una BLEE tipo CTX-M y/o tipo SHV, solas o acompañadas de una BLEE tipo TEM. En lo que respecta al tipo de BLEE, la más frecuente resultaron ser CTX-M 14, seguida de TEM-116, SHV-2, SHV-12, CTX-M 15, CTX-M 9. Tambien describimos la primera cepa productora en España de CTX-M 27 y la primera que porta el gen qnr. Se observó cómo con el incremento en el tipo de BLEEs simultáneas producidas por la cepa aumentaba la CIM que presentaba ésta, y diferentes valores de CIM para las distintas cefalosporinas según el tipo de BLEE producida. En lo que respecta a la epidemiología molecular de las cepas se encontró una gran diversidad clonal entre las cepas, con una escasa homología entre ellas, a excepción de las cepas de Salmonella productoras de CTX-M 9 y algunas cepas de K. pneumoniae productoras de SHV-2.

Autor: ANTÓN FIDALGO NURIA.
Año: 2006.
Universidad: LEÓN [www.unileon.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES.
Centro de realización: INSTITUTO BIOTECNOLOGÍA (INBIOTEC).

Resumen: La pimaricina representa una molécula prototipo de los polienos glicosilados. Es producida por Streptomyces natalensis ATCC 27448 y se utiliza rutinariamente en la industria alimentaria para prevenir la contaminación por mohos en quesos y otros alimentos no estériles (carnes curadas, salchichas, fiambres, etc.), además se está aplicando con gran éxito en la prevención de infecciones fúngicas en oftalmología, especialmente tras operaciones de córnea, y en la prevención y tratamiento de queratitis del mismo origen. La pimaricina es un macrólido tetraeno con un anillo macrocíclico (pimaricinolida) de 26 átomos de carbono, incluyendo el cierre por el enlace lactona -CO-O-. Se caracterizó la agrupacion génica responsable de la biosíntesis de este polieno (90 KB), donde se han encontrado 13 módulos de poliquétido sintasa distribuidos entre cinco enzimas gigantes (PIMS0 a PIMS4). Trece genes adicionales parecen gobernar las modificaciones del esqueleto poliquétido formado por las cinco enzimas citadas, su secreción y su regulación. Este trabajo se centró en la búsqueda, clonación, secuenciación y caracterización de posibles genes reguladores de la biosíntesis de pimaricina. La secuenciación del extremo izquierdo de la agrupación génica responsable de la síntesis de la pimaricina reveló la presencia de un gen pimR, un gen de 3597 pb que codifica una proteína reguladora PimR de 1198 aa. PimR, representa el arquetipo de una nueva clase de reguladores, que combinan un dominio regulador de la biosíntesis de antibióticos de Streptomyces (SARP) en la sección N-terminal, con una sección C-terminal homóloga a guanilato ciclasas (cyc) y a reguladores de gran tamaño dependientes de ATP de la familia LuxR (LAL). La inactivación de esta proteína hace que la cepa no produzca pimaricina, lo que hace a PimR un regulador positivo de la síntesis de pimaricina. Tras estudios a nivel transcripcional, se vio que esta proteína actúa dismi- nuyendo los niveles de transcripción de todos los genes de la agrupación génica de la pimaricina y bloqueando la transcripción del gen pimE. pimE es un gen que codifica una colesterol oxidasa funcional, cuya inactivación bloquea la síntesis de pimaricina. Siguiendo con la secuenciación de la parte izquierda de la agrupación génica de la biosíntesis de la pimaricina se identificó un nuevo gen, el gen pimM, de 579 pb que codifica la proteína PimM de 192 aa. PimM pertenece a este grupo de reguladores, presentando un dominio PAS en su extremo N-terminal y en la zona C-terminal un dominio de unión de ADN HTH del tipo LuxR. La presencia de un dominio PAS dentro de PimM sugiere que esta proteína podría responder como un sensor a cambios en los niveles de energía en la célula (Ponting y Aravind, 1997), mientras que el motivo HTH nos informa de la habilidad de PimM para unir ADN (Stevens et al., 1994) y de esta manera su posible implicación en la regulación de la expresión de los genes de la pimaricina. La disfuncionalidad de PimM provoca la falta de producción de pimaricina en Streptomyces natalensis. Un estudio a nivel transcripcional sobre todos los genes de la agrupación génica de la pimaricina se vio como PimM actúa sobre pimS1-S0-D-F-G-C-B y disminuye la transcripción de pimJ-I-K-A-S2-S3-S4. Curiosamente no se produjeron diferencias en la transcripción respecto a la cepa silvestre en los genes pimR, pimE y pimH, lo que sugiere que pimM y el primer gen regulador para la biosíntesis de pimaricina pimR (Antón et al., 2004), funcionan independientemente el uno del otro. En conclusión, muy probablemente estos dos reguladores, PimR y PimM, pertenecen a circuitos de regulación diferentes.

Autor: GÓMEZ ESCRIBANO JUAN PABLO.
Año: 2006.
Universidad: LEÓN [www.unileon.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES.

Resumen: STREPTOMYCES CLAVULIGERUS ES UN MICROORGANISMO DE GRAN IMPORTANCIA BIOTECNOLÓGICA POR SER PRODUCTOR DEL ANTIBIÓTICO BETA-LACTÁMICO CEFALOSPORINA C Y DEL INHIBIDOR DE BETA-LACTAMASAS ÁCIDO CLAVULÁNICO. LA "RESPUESTA ESTRICTA" ES UN MECANISMO DE ADAPTACIÓN BACTERIANA QUE CONSISTE EN UN COMPLEJO CONJUNTO DE CAMBIOS FISIOLÓGICOS EN RESPUESTA A CONDICIONES DE ESCASEZ DE NUTRIENTES QUE PERMITEN LA SUPERVIVENCIA DE LA CÉLULA CON UN METABOLISMO BASAL. LA PRINCIPAL CARACTERÍSTICA ES UN FUERTE DESCENSO DE LA SÍNTESIS DE ARN TRAS LA PRIVACIÓN DE AMINOÁCIDOS. LA PRESENCIA DE UN ARNT DESCARGADO EN EL SITIO ACEPTOR DEL RIBOSOMA ACTIVA LA ENZIMA RELA, VINCULADA AL RIBOSOMA A TRAVÉS DE LA PROTEÍNA L11 (CODIFICADA POR EL GEN RPLK). RELA CATALIZA LA TRANSFERENCIA DE UN GRUPO PIROFOSFORILO DESDE EL ATP AL GRUPO 3'-HIDROXILO DEL GTP O DEL GDP, ORIGINANDO EL COMPUESTO PPPGPP O PPGPP RESPECTIVAMENTE (REFERIDOS AMBOS COMO (P)PPGPP). EN LOS MICROORGANISMOS DEL GÉNERO STREPTOMYCES, LA CAPACIDAD DE SÍNTESIS DE (P)PPGPP HA SIDO CORRELACIONADA DIRECTAMENTE CON LA CAPACIDAD DE DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA (ESPORULACIÓN) Y FISIOLÓGICA (PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS). MUTANTES RELC (RPLK) Y RELA ESTÁN PERJUDICADOS EN LA ESPORULACIÓN Y PRODUCEN MENOS ANTIBIÓTICO QUE LA CEPA PARENTAL. EN ESTE TRABAJO SE HAN CONSTRUIDO DOS MUTANTES DE S. CLAVULIGERUS NULOS EN RELA, Y UN MUTANTE RELC POR DELECIÓN DE 12 PB INTERNOS DE RPLK. AMBOS MUTANTES NULOS RELA CARECÍAN DE PRODUCCIÓN DETECTABLE DE (P)PPGPP, Y SE MOSTRARON INCAPACES DE FORMAR MICELIO AÉREO Y ESPORULAR. SIN EMBARGO, AMBOS MUTANTES RELA PRODUJERON HASTA 6 Y 15 VECES MÁS CEFAMICINA C Y ÁCIDO CLAVULÁNICO QUE LA CEPA SILVESTRE. EL MUTANTE RELC (RPLK) PRODUCÍA UN 20% DE LA CANTIDAD DE (P)PPGPP DETECTADA EN LA CEPA SILVESTRE, Y ESTABA PERJUDICADO EN LA ESPORULACIÓN, AUNQUE SÍ FORMA MICELIO AÉREO. ESTE MUTANTE MOSTRÓ UNA REDUCIDA SÍNTESIS DE ANTIBIÓTICOS, PRODUCIENDO ENTRE EL 66 Y 79% MENOS ÁCIDO CLAVULÁNICO Y 71 A 84% MENOS CEFAMICINA C QUE LA CEPA PARENTAL. LOS ESTUDIOS TRANSCRIPCIONALES MOSTRARON QUE LA MAYOR PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS POR LA CEPA DELECIONADA EN RELA SE DEBE A UNA MAYOR TRANSCRIPCIÓN DE LOS GENES PARA BIOSÍNTESIS DE ANTIBIÓTICOS, MIENTRAS QUE LA CEPA RELC (RPLK) TENÍA UNA TRANSCRIPCIÓN REDUCIDA DE LOS MISMOS. ADICIONALMENTE, SE CORRELACIONÓ EN LA CEPA SILVESTRE UNA REDUCCIÓN EN LA TRANSCRIPCIÓN DE LOS GENES DE BIOSÍNTESIS DE ANTIBIÓTICOS EN PARALELO A LA MÁXIMA PRODUCCIÓN DE (P)PPGPP DURANTE LA ENTRADA EN FASE ESTACIONARIA DE CRECIMIENTO. SE CONCLUYE QUE LA SÍNTESIS DE (P)PPGPP ES UN REQUISITO PARA LA CORRECTA DIFERENCIACIÓN MORFOLÓGICA EN S. CLAVULIGERUS, PERO NO PARA LA BIOSÍNTESIS DE ANTIBIÓTICOS, A LA QUE AFECTA NEGATIVAMENTE.

Autor: CEPEDA GARCÍA CRISTINA.
Año: 2006.
Universidad: LEÓN [www.unileon.es].
Centro de lectura: FAC. DE CIENCIAS BIOLÓ. Y AMBIEN..
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE LEÓN.

Resumen: La producción de penicilina en P. chrysogenum está sometida a regulación por fuente de carbono. El factor transcripcional CreA es el responsable de este tipo de regulación de diversos genes pero hasta ahora no se había demostrado su implicación en la regulación por carbono de la ruta de biosíntesis de penicilina en este hongo. Este es el objetivo de la presente tesis. Se ha demostrado que la caja creA-1 presente en el promotor del gen pcbAB, que codifica la enzima responsable del primer paso de la ruta biosintética de penicilina en P. chrysogenum, participa en la regulación por carbono de dicho gen, ya que la mutación de esta caja provoca un aumento en la expresión del gen pcbAB en medios suplementados con glucosa. La mutación de las cajas creA-5 y creA-6 demuestra que, aunque son funcionales y participan en la regulación por fuente de carbono del gen pcbAB, su importancia no es comparable a la de la caja creA-1. Por otro lado, se estudio la propia proteína CreA para ver su implicación en la producción de penicilina. La deleción del gen creA resultó en un fenotipo extremo, donde se encuentran seriamente alterados tanto el correcto desarrollo del micelio como la producción de penicilina. Mediante la expresión de ARN antisentido se determinó que la atenuación del gen creA resulta en una mayor producción de penicilina, independientemente de la fuente de carbono presente en el medio, y este aumento va acompañado por una mayor expresión de los genes pcbAB y pcbC. Por último, la sobreexpresión del gen creA resultó en una reducción drástica de la producción de penicilina, lo que apoya los datos anteriores y confirma que el factor CreA es el responsable de la regulación por fuente de carbono de la ruta de biosíntesis de pencilina en P. chrysogenum.

Autor: Cartelle Gestal Mónica.
Año: 2006.
Universidad: A CORUÑA [www.udc.es].
Centro de lectura: Facultad de Ciencias de la Salud.
Centro de realización: Facultad de Ciencias.

Resumen: 1. Realizar estudios de epidemiología molecular en cepas clínicas de enterobacterias (Escherichia coli y Klebsiella spp) con B-lactamasas de espectro extendido (BLEE) aisladas durante el año 2001 en el área asistida por el Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo. 2. Descripción de nuevas B-lactamasas de espectro extendido (BLEE). 3. Estudiar la implicación de la posición Arg276 en las B-lactamasas del tipo CTX-M y su relación con la sensibilidad o resistencia a la inhibición por clavulánico. 4. Realizar estudios de aminoácidos clave en la hidrólisis de cefotaxima en B-lactamasas del tipo CTX-M, empleando como modelo la CTX-M-14 y CTX-M-1.

Autor: FRANCO CIRERA SANDA.
Año: 2006.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El virus de la hepatitis C infecta a 800.000 personas en toda España y cerca de 200 millones en todo el mundo. El VHC pertenece a la familia Falviviridae, cuyo genoma (9.6Kb) es una molécula de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva. Es un virus altamente variable y se distribuye a quasiespecies. En España, cerca del 50% de individuos infectados con VHI-1, están coinfectados con el VHC. En este grupo de pacientes, el VIH-1 acelera el curso de la infección producida por el VHC. Existen 6 genotipos y varios subtipos del VHC, siendo el genotipo prevalente en España, el 1b en individuos monoinfectados con VHC, y los genotipos 1a, 3a y 4 en los individuos coinfectados con VHC y VIH-1. La región NS3/4A proteasa se encarga de procesar la proliproteína del VHC y de desmantelar la defensa antivírica intracelular mediante el bloque del factor IRF-3. Procesa dos molecular (TRIF i CARDIF), que son las responsables de activar IRF-3 y producir IFN. La única terapia disponible se basa en interferón pegilado y ribavirina, con un porcentaje bajo (40%) de respuesta en individuos infectados con genotipo 1 ó 4. La búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas basadas en regiones del VHC (NS3 y NS5B),. Es un objetivo prioritario para la práctica clínica. En la presente tesis, se analiza la diversidad poblacional, a nivel de nucleótido y aminoácido, de la proteasas NS3/4A del VHC de dos pacientes coinfectados (VHC-VIH) y un paciente monoinfectado (VHC), que no han recibido terapia contra el VHC. Se estudia la posible relación entre la quasiespecies de la región NS3 proteaasa (NS3pro) y la persistencia dela enfermedad. Se evalúa la actividad catalítica de las proteasas obtenidas para cada pacientes y se intenta relacionar con la variabilidad del gen NS3pro. Se estudian las actividades catalíticas de proteasas de distintos genotipos y se intenta ver si existe alguna relación entre actividad, genotipo y respuesta al tratamiento. Se explora la importancia de la proteína NS4 en la actividad dela NS3pro y la interacción entre cofactores y proteasas de distinto genotipo. Finalmente, se estudia las posibles relaciones filogenéticas de dos aislados del VHC de genotipo 4, especialmente en regiones implicadas en respuesta al tratamiento. Se concluye que la distribución en quasiespecies de la NS3pro, tanto a nivel de nucleótido como a nivel de aminoácidos, es distinta en los tres pacientes. Esto nos indica que hay distintas fuerzas selectivas actuando sobre las tres poblaciones víricas. Así, en dos de los tres pacientes, se detectan mutaciones de resistencia a los inhibieres de la proteasas. Existe un amplio margen de actividades enzimáticas dentro de cada quasiespecie, indicando la gran capacidad que tiene este enzima en tolerar cambios ambientales. La actividad enzimática viene determinada pro el punto de corte que es procesado. En la mayoría de las combinaciones proteasas-cofactor de distintos genotipo, el cambio de cofactor no afecta a la actividad enzimática aunque en ciertas combinaciones se produce una pérdida total de la actividad del enzima, sugiriendo la importancia de ciertas sustituciones de la NS3pro que interaccionan con el cofactor. Existe una coevolución entre la NS3pro y el cofactor NS4A. Por tanto, la interacción cofactor-enzima podría ser una potencial diana para el estudio de nuevos inhibidores. La obtención de dos nuevos genomas de genotipo 4 nos sugiere que este genotipo está filogenéticamente más relacionado con el fenotipo 1 que no con otros genotipos del virus.

Autor: Prado Prado Francisco.
Año: 2006.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA [www.usc.es].
Centro de lectura: Facultad de Farmacia.
Centro de realización: Facultad de Química.

Resumen: En la presente Tesis Doctoral se han desarrollado modelos teóricos de predicción de la actividad antimicrobiana (antibacteriana, antifúngica, antiviral y antiparasitaria) mediante la utilización de métodos de cálculo de descriptores moleculares en combinación con técnicas estadísticas para establecer una relación entre la estructura molecular y la actividad biológica (métodos QSAR). Se im plementó para los objetivos previstos nuestra propia metodología MARCH-INSIDE (Markovian Chemical In Silico Design). Adicionalmente, en algunos casos, fueron desarrolladas medologías de redes para la predicción de los mecanismos de acción farmacológica de diferentes compuestos.