FISIOLOGIA BACTERIANA

Autor: MALLORQUÍ FERNÁNDEZ NOEMÍ.
Año: 2003.
Universidad: GIRONA [www.udg.es].
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UDG.

Resumen: El presente trabajo se centra en el estudio a paartir de distintos niveles de los carotenoides de las especies marrones de Bacterias Verdes de Azufre (GSB,del inglés Green Sulfur Bacteria). El objetivo global ha sido el de averiguar cual es la función de estos pigmentos enestos microorganismos así como ampliar los conocimientos de su estructura y entrcciones conlos otres pigmentos del aparato fotosintético. En primer lugar se diseñó un método de cromotografía líquida de alta rasolución (HPLC) para anilizar de forma más precisa y rápida los carotenides de distintas cepas de GSB (capítulo 3). Este método se caracteriza por una purificaciín precvia de los extractos pigmentarios mediante columnas de alúmina para eliminar las cateroclorofilas (BLLS).Esto permitó analizar con una elevada resolución y etan sólo 45 min. De carrera cromatográfica los distintos carotenoides y sus precursores, así como la configuaraciones trans y cis de sus isómeros.El segundo delos métodos utilizado consistió en una modificación del método de Borrego y Garcia-Gil (1994) y permitió la separación precisa de todo tipo de pigmentos , procedentes tanto de culrivos puros como de muestras de carácter complejo. Un ejemplo concreto fueron los sedimentos antiguos de la zona lacustre de Banyoles. En estos sedimentos (0,7-1,5 millones de años de antigüedad) se detectron , entre otros pigmentos, carotenoides específicos de las especies marrones de GSB lo que permitió confirmar la presencia deestas bacterias en la zona lacustre de Banyoles ya des del Pleistoceno inferior. En este primer capítulo también se analizaron los carotenoides de Cholrobium (Chl.) phaeobacteroides CL 1401 mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masaa (LC-MS/MS),con el objetivo de confirmar su identificación y su peso molecular. Además , también se analizó el efecto de la temperatura, la luz y distintos agentes oxidantes y reductores sobre la xomposición cuantitativa y calitativa de los carotnoides y las BCLS de esta especie.Estos experimentos permitieroon confirmar el carácter fotosensible delas BCLS y que los isómeros trans/cis de los distintos carotenoides no son artefactos producidos durante la manipulación de las muestras sino que son constitutivos del aparato fotosintético de estos microorganismos. El capítulo 4 incluye los experimentos de fisiología realizados con algunas especies de GSB, centrados en elucidar los mecanismos en dinámica de síntesis de los distintos pigmentos (BCL antena, BCL a i carotenoides ) durante el crecimiento de estas especies. Estas investigaciones permitieron monitorizar también las variaciones en el número de CR durante el proceso de adaptación lumínica. A partir de la cuantificaciín de la BCL663, el aceptor primero en la cadena de transporte de electrones en GSB, se calculó el número de CR. La estimación de la relación CR/clorosoma se llevó a cabo, primero a partir de datos estequiométricos y biométricos presentes en la bibligrafía y luego a partir de los datos experimentales de este trabajo. El vuen ajuste entre las distintas estimaciones dio solidez al valor estequiométrico calculado, el cual fue, como promedio, de unos 70 CR por clorosoma. En este capítulo de fisiología también se estudiaron las variriones en las relaciones trans/cis entre los principales carotenoides de las especies marrones de GSB.Las relaciones calculadas para los culrivos no resentaron diferencias destacadas en función de las condiciones de iluminación de estos. En las dos condiciones estudiadas, alta y baja intensidad de luz, el valor de la relación trans/cis fue aproxomadamente de 2. En clorosomas aislados de distintas cepar marrones de GSB la relación también fue aproximadamente de 2, tanto para el isorenierateno (Isr) como para el B-isore 8 niearate 5cc no (B-Isr). En poblaciones naturales de Chl. Pheobacteroides esta la relación fue también de 2 isómeros trans por cada isómero cis, manteniéndose constante tanto en profundidad como a lo largo del tiempo. Finalmente , en el capítulo 5 se presenta un marcador molecular que permitió la identificación específica de especies marrones de GSB. A pesar que su diseño inicial fue a partir de un gen implicado en la síntesis de carotenoides (crtY, que codifica par una licopeno ciclasa) la secuencia final a partir de la cual se han obtenido los encebadores selectivos está ralcionada con la familia de protínas de las Policétido-ceto-sintasas(PKT). A pesar de todo, la nueva herramienta puede ser de gran utilidad para la discriminación de especies marrones de GSB respecto a las verde en poblaciones mixtas como las que se encuentran en ambientes naturales y abre las puertas a futuros experimentos de ecología microbiana utilizando técnicas como la PCR en tiempo real, que permitiría la monitorización selectiva de las polblaciones de especies marrones de GSB en ecositemas naturales.

Autor: AZUA PEREZ IÑIGO.
Año: 2004.
Universidad: PAÍS VASCO [www.ehu.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA.

Resumen: Los agregados marinos, ubicuos y de diferente origen, están enriquecidos en materia orgánica y fuertemente colonizados por microorganismos. Son eliminados del medio mediante disgregación física, sedimentación diferencial y descomposición biológica, y participan en el recambio, descomposición y sedimentación de la materia orgánica en el mar. La descomposición procariótica comprende respiración, producción de biomasa y/o solubilización del agregado. Los dos hábitats, agregado y fase líquida, presentan dos comunidades procarióticas, de vida libre y adherida, con diferencias morfológicas, fisiológicas y taxonómicas. El objetivo de este trabajo es analizar la descomposición procariótica de agregados orgánicos marinos. Se estudia en procariotas adheridos y de vida libre el ataque primario hidrolítico, la incorporación de materia orgánica liberada y la producción de biomasa. Se analizan tres tipos de agregados: agregados marinos de aguas oligotróficas y dos tipos de agregados formados en el laboratorio, agregados naturales y fitoplanctónicos. Los agregados fitoplanctónicos, con abundantes compuestos fácilmente utilizables, simulan a los formados durante el crecimiento masivo fitoplanctónico. Los naturales simulan a gregados empobrecidos y más refractarios formados por agregación de diferentes partículas marinas. Ambos procariotas presentan diferencias tanto en la hidrólisis como en la toma de compuestos orgánicos. El de vida libre expresa enzimas hidrolíticos y sistemas de transporte con mayor afinidad debido a la escasez de nutrientes. Estas diferencias explicarían las cinéticas multifásicas observadas en los sistemas marinos. En agregados fitoplanctónicos el procariota obtiene ventaja de su adherencia mediante superior superior hidrólisis, mientras en agregados naturales, más pobres, no se observan diferencias entre procariotas. En aguas oligotróficas el procariota adherido presenta superior toma sólo en partículas poco colonizadas y presumiblemente recién formadas. En agregados fitoplanctónicos y naturales, se observa una estrategia adaptativa, descenso en la toma y aumento en la afinidad, a medida que aumenta el grado de colonización y se empobrecen cuantitativa y cualitativamente los agregados. Los agregados son centros de alta actividad y fuerte crecimiento procariótico sólo recién formados. A medida que son colonizados y degradados se producen cambios químicos y dejan de ser un hábitat favorable. En agregados fitoplanctónicos recién formados la hidrólisis y la toma son procesos acoplados. Sin embargo, durante su descomposición se desacoplan al disminuir la toma mientras permanecen alta la hidrólisis. Debido al desacomplamiento se solubilizan compuestos orgánicos a la fase líquida favoreciendo el crecimiento de la comunidad de vida libre. Así, los agregados marinos actúan como reactores enzimáticos que liberan materia orgánica durante su sedimentación lo que ayudaría a explicar las velocidades de crecimiento que alcanzan los procariotas de vida libre.

Autor: JIMÉNEZ BELENGUER ANA ISABEL.
Año: 2004.
Universidad: POLITÉCNICA DE VALENCIA [www.upv.es].
Centro de lectura: Dep. Biotecnologia.
Centro de realización: Universidad Politécnica de Valencia.

Resumen: El género Helicobacter comprende 23 especies de bacterias microaerófilas. La especie más estudiada es Helicobacter pylori, responsable del 90% de las úlceras pépticas y relacionada estrechamente con el desarrollo de cáncer gástrico. Los mecanismos de transmisión de este microorganismo no están totalmente determinados. Se ha detectado su presencia en heces, agua de bebida, leche y vegetales, aunque en muy pocos casos ha podido ser aislado. Recientemente se ha sugerido, además, que Helicobacter pylori puede ser resistente a las concentraciones de cloro y ozono utilizadas para potabilizar el agua de distribución. Por otra parte, estudios experimentales han demostrado que en condiciones de estrés ambiental estos microorganismos pueden entrar en una fase viable pero no cultivable (VNC), en la que, a pesar de no poder ser recuperados, conservan distintas actividades metabólicas y expresan factores de virulencia. La inducción de este estado VNC, que se acompaña de cambios morfológicos (paso a forma cocoide), ha sido propuesta como un probable mecanismo de supervivencia en el ambiente, que favorecería su transmisión. En este trabajo se ha estudiado la supervivencia de una cepa de H. pylori perteneciente a nuestra colección, en distintos modelos de microcosmos acuáticos a diferentes temperaturas. Se ha comprobado que las células de H. pylori mantenidas en tampón fosfato salino PBS a 11ºC, son cultivables durante 12 días, mientras que en agua no clorada, a la misma temperatura, permanecen cultivables hasta 5 días. Así mismo, a temperaturas más bajas la cultivabilidad en PBS persiste durante más tiempo, y se detectan células cultivables hasta los 22 días. También se ha observado la existencia de formas helicoidales viables no cultivables tanto en agua superficial como en PBS. Al valorar la supervivencia de la cepa HBTC6 de H. pylori en presencia de cloro se ha visto que, aunque su cultivabilidad es extremadamente más corta, apenas 5 minutos, persisten formas helicoidales y cocoides a las 24h. de exposición. A lo largo del estudio, en todos los microcosmos se mantuvieron constantes diversos parámetros, tales como el contenido en rRNA y DNA, así como la producción de catalasa y ureasa, enzimas relacionadas con la virulencia. Estos resultados ponen de manifiesto la permanencia de células viables no cultivables (VNC) de H.pylori en sistemas acuáticos durante largos periodos de tiempo. Una de las mayores preocupaciones es saber si estas formas son potencialmente infectivas. Para ello, es necesario determinar la capacidad de estas células de volver a ser cultivables. La búsqueda de medios de cultivo que puedan recuperar este microorrganismo de su estado VNC es, además, crucial para su aislamiento a partir de muestras ambientales. En este trabajo se han ensayado 15 medios de cultivo, con el objeto de determinar si las células de H.pylori en estado VNC recuperan su capacidad de replicación. A pesar de que no pudieron ser recuperada por cultivo en placa, los resultados obtenidos muestran la persistencia de las formas viables en todos ellos, incluso 14 días despúes de su incubación, lo que indca el mantenimiento de una cierta potencialidad metabólica.

Autor: Hernández Romero Diana.
Año: 2005.
Universidad: MURCIA [www.um.es].
Centro de lectura: Facultad de Biología. Universidad de Murcia.
Centro de realización: Facultad de Biología.

Resumen: Las polifenol oxidasas (PPO) son enzimas que oxidan fenoles utilizando oxígeno. Se dividen en lacasas y tirosinasas y son enzimas de gran interés tanto biotecnológico (por su utilización en la degradación de productos recalcitrantes, en la industria del papel, en la de colorantes y pigmentos, etc) como por su participación en la biosíntesis de melaninas que son pigmentos generalmente negros o marrones implicados en numerosas funciones, la mayoría de ellas de protección. Se han encontrado en el genoma de Ralstonia solanacearum hasta cuatro posibles genes que podrían codificar enzimas con actividad PPO. Entre los objetivos de la Tesis Doctoral se destacan la detección y optimización de estas actividades PPO en R. solanacearum, la mutagénesis de los posibles genes responsables de las actividades y la purificación y caracterización de las enzimas con actividad PPO. Otro objetivo estará basado en la evaluación de los efectos de la adición de fenoles en la fisiología de R. solanacearum así como de los posibles efectos en la capacidad infectiva de los mutantes frente a la cepa silvestre. A través de la construcción de mutantes nulos mediante recombinación homóloga pudimos disponer de los mutantes afectados en los diferentes genes susceptibles de codificar actividades PPO. Una vez obtenidos los extractos celulares de dichos mutantes observamos la pérdida de una actividad PPO concreta asociada a cada uno de los genes mutados, que sin embargo no coincidía con la anotación previa de estos productos génicos por lo que proponemos un cambio en la nomenclatura de los mismos, de manera que el producto del gen RSc0337 es una tirosinasa, el del gen RSc1501 es una catecol oxidasa y el gen RSp1530 codifica una lacasa. Se descartó el estudio del gen RSp0656 por codificar una proteína de resistencia al cobre CopA y no codificar por tanto una PPO. Se consiguió la purificación de los productos protéicos de estos genes, así como una caracterización bioquímica y cinética de los mismos observándose en el caso de la tirosinasa una mayor afinidad por tirosina que por dopa, lo que propició el desarrollo de una patente por nuestro grupo sobre el proceso de obtención de L-dopa utilizando la tirosinasa de R. solanacearum. Tras el trabajo de la caracterización de estas enzimas, podemos establecer una serie de criterios estructurales que permiten diferenciar a las tirosinasas de las catecol oxidasas en función de las características de los resíduos aminoacídicos próximos a los centros de cobre. Otro importante resultado se observa cuando adicionamos compuestos fenólicos a cultivos de R. solanacearum, donde observamos una mayor sensibilidad a los mismos por parte de los mutantes afectados en las PPO, lo que sugiere una participación de las mismas en procesos de detoxificación de dichos compuestos, procesos que podrían tener una explicación fisiológica en la defensa de la bacteria frente al ataque de la planta que produce estos compuestos como respuesta a diferentes estreses, como puede ser la infección por parte de un patógeno. Adicionalmente también hemos podido observar la síntesis de melaninas y otros pigmentos asociados a las actividades PPO en R. solanacearum. Finalmente no hemos podido evidenciar una pérdida de capacidad infectiva asociada a la falta de alguna PPO concreta, lo que en principio podría explicarse por el hecho de que el proceso infeccioso es un proceso multifactorial donde la afectación de una PPO podría no ocasonar un efecto fenotípicamente tan claro como para resultar visible en un ensayo de patogenicidad cualitativo.

Autor: URETA BARRIOS ANA CLAUDIA.
Año: 2005.
Universidad: POLITÉCNICA DE MADRID [www.upm.es].
Centro de lectura: ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: ESCUELA TECNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGONOMOS.

Resumen: En la simbiosis Rhizobium-leguminosas existen dos enzimas clave que intervienen en el metabolismo del hidrógeno molecular (H2): la nitrogesanas y la hidrogenasa. La nitrogenasa cataliza la reducción de nitrógeno atmosférico a amonio y este proceso conlleva la producción de hidrógeno. Este hidrógeno se pierde como gas por lo que constituye una pérdida de energía en el proceso de fijación de nitrógeno. Las hidrogenasas cataliza la oxidación de hidrogeno molecular a protenes. Los electrones provenientes de la oxidación de hidrógeno se incorporan a la cadena respiratoria hasta el aceptor final que es el oxígeno y en este proceso puede estar acoplado a la producción de energía (Ruíz-Argüeso et al, 2000). El reciclado de hidrógeno se ha asociado a un aumento de la productividad de las plantas debido al incremento de la eficiencia energética en la simbiosis Rhizobium-leguminosas. La hidrogenasa es una enzima heterodimérica que esta unida a la membrana y contiene un centro activo bimetálico [NiFe] en la subunidad mayor. La incorporación de níquel en el centro activo de la hidrogenasa es un paso esencial en la síntesis de la enzima. Se ha establecido que la disponibilidad de níquel limita la expresión de la hidrogenasa a nivel de procesamiento de las subunidades de la enzima. Se ha establecido que la disponibilidad de níquel limita la expresión de la hidrogenasa a nivel de procesamiento de las subunidades de la enzima en plantas crecidas en vermiculita (Brito et al, 1994), pero se desconoce si esta limitación existe en condiciones naturales de cultivo. Los objetivos de esta tesis doctoral son: 1,- Analizar el nivel de níquel del suelo como posible factor limitante en la expresión dela actividad hidrogenasa en suelos agrícolas para este estudio se analizó el efecto de la adición de níquel a los suelos. Se seleccionaron 6 suelos agrícolas representativos de la Comunidad de Madrid de los que se determinaron sus características físico-químicas. Estos suelos se usaron como sustrato para el crecimiento de guisantes (Pisum sativum) inoculados con una cepa hidrogenasa positiva de R.leguminosarum. El análisis del metabolismo del hidrógeno en los bacteroides de estas plantas demostró que el Ni presente en estos suelos no es suficiente par reciclar el 100% del hidrógeno producido en el proceso de fijación de nitrógeno. Como estrategia para superar la limitación por níquel se usó una cepa más eficientes en el reciclado de hidrógeno. Estos resultados se correlacionaron con ensayos de inmunodetección donde se analizó el efecto del níquel en el procesamiento de la subunidad mayor de la hidrogenasa y se vio que el procesamiento de la enzima depende de los niveles de níquel del suelo. Los resultados indican que los bajos niveles de níquel de los suelos constituyen un factor limitante para la actividad hidrogenasa en la simbiosis R.leguminosarum-guisantes. 2,- Evaluar el beneficio asociado a la presencia del sistema hidrogenasa en inoculantes rizobaianos. Para evaluar el beneficio asociado a la presencia del sistema hidrogenasa en inoculantes rizobianos, se integró el sistema hup de Rhizobium leguminosarum bv viciae a cepas hidrogenasa negativas noduladoras de vez (Vicia sativa) mediante el uso de un minitransposón (TnHB100, Báscones et al, 2000). Este sistema permitió integrar en forma estable la agrupación hup en el genoma de la bacteria receptora. Se seleccionaron dos cepas con inserciones localizadas en sitios no relevantes del genoma y se analizó la actividad hidrogenasa y el comportamiento simbiótico. Una de las cepas mostró incrementos significativos en acumulación de nitrógeno asociada la presencia de la capacidad de reciclado de hidrógeno. 3,- Realizar un análisis comparativo de genomas de cepas de Rhizobium leguminosarum capaces de expresar el sistema hidrogenasa. Se realizó la comparación genotípica de las cepas de R.leguminosarum UPM791, poseedora del sistema hup y 3841, cuyo genoma ha sido secuenciado, utilizando 8 microarr 426 ays de ADN generados para la cepa 3841. Previo al estudio comparativo se verificó que el sistema hup se expresa correctamente en la cepa 3841. La comparación reveló que el 78% de los genes se encontraban conservados en ambas cepas, indicando que estos microaarays son útiles para el análisis de los factores involucrados en el control de la expresión de la hidrogenasa de UPM791.