CRYPTOSPORIDIUM EN MOLUSCOS BIVALVOSAutor:
GÓMEZ COUSO HIPÓLITO.
Año: 2005.
Universidad:
SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.
Resumen: ESTUDIOS DE CONTAMINACIÓN NATURAL Durante el período comprendido entre los meses de octubre de 2000 y septiembre de 2001, se investigó la presencia y la viabilidad de los ooquistes de Cryptosoporidium spp., en 241 muestras de moluscos bivalvos destinados al consumo humano suministradas por la Unidad de Control de Moluscos del Instituto de Acuicultura de la Universidad de Santiago de Compostela. Mediante una técnica de IFD, a la que se incorporó el colorante vital fluorogénico ioduro de propidio, se observaron ooquistes de Cryptosporidium spp., en 83 muestras (34,4% de contaminación). De ellas, 44 (53,0%) contenían ooquistes potencialmente viables. Considerando el origen de las muestras, se detectó contaminación en 69 de las 203 muestras recogidas en el litoral galleo (34,0% de contaminación y 49,3% de viabilidad ooquística) y en 14 de las 38 muestras procedentes de otros países de la Unión Europea (36,8% de contaminación y 71,4% de viabilidad ooquística). Se comprobó una ausencia de correlación (2, P=0,20) entre la contaminación por Cryptosporidium spp., y el proceso de depuración al que fueron sometidas algunas de las muestras (entre uno y más de 14 días). Tampoco se observó una asociación significativa (2, P=0,85) entre los niveles de contaminación microbiológica y de contaminación por Cryptosporidium spp., detectados en los moluscos bivalvos analizados. Previamente a la caracterización molecular de los aislados de Cryptosoporidium spp., se confirmó la ausencia de inhibidores de la técnica de PCR en el ADN extraído de los moluscos y contaminado con ADN cryptosporidial. Además, utilizando 49 muestras de moluscos bivalvos seleccionadas al azar de las 241 analizadas con anterioridad, se comprobó una asociación significativa (Test Exacto de Fisher, P=0,019) entre los resultados obtenidos mediante las técnicas de IFD y de PCR. La combinación de las técnicas de RFLP, clonación y secuenciación del ADN permitió identificar la existencia de C.parvum y C.hominis, especies actualmente consideradas responsables de la mayoría de las infecciones humanas. El estudio realizado en muestras hídricas (7 ríos, 16 aguas residuales depuradas y 11 aguas residuales brutas) y en 184 muestras biológicas (mejillón M.galloprovincialis) recogidas en 4 estuarios (Rías Baixas), importantes zonas de producción de moluscos bivalvos y de interés turístico, demostró una amplia contaminación ambiental por Cryptosporidium y Giardia. Mediante la técnica de IFD, se comprobó la presencia de ooquistes de Cryptosporidium spp., en 5 muestras de agua fluvial (71,4%); en 8 aguas residuales depuradas (50,0%); en 7 aguas residuales brutas (63,6%) y en 42 muestras biológicas (22,87%). De igual forma, se detectaron quistes de Giardia spp., en 6 muestras fluviales (85,7%); en 14 aguas residuales depuradas (84,5%); en 10 aguas residuales brutas (90,9%) y en 77 muestras de mejillón (41,8%). Se observó una gran variabilidad entre los valores cuantitativas hallados para ambos parásitos y un predominio de Giardia spp., vs Cryptosporidium spp., no sólo en el tipo de muestra analizada sino también en las concentraciones detectadas, con la salvedad de las muestras biológicas en las que Cryptosporidium spp., presentó valores superiores de concentración. Se demostró un incremento en la contaminación por ambos enteroparásitos a medida que aumentan los niveles de contaminación bacteriana, tanto en la muestra biológica como en la zona de cultivo. Sin embargo, sólo se comprobó una asociación estadísticamente significativa con la existencia de quistes de Giardia spp. (Test Exacto de Fisher, P=0,026; 2, P=0,008). La caracterización molecular de los aislados de Cryptosporidium spp., en las muestras ambientales y biológicas, permitió identificar a C.muris como la especie contaminante en tres muestras de agua residual depurada: a C.bailey en una muestra de agua residual bruta y a C.parvum en la totalidad delas muestras biológicas positivas mediante la técnica de PCR (n=26). ESTUDIOS DE CONTAMINACIÓN EXPERIMENTAL Los estudios de contaminación experimental se realizaron en las instalaciones del Instituto de Acuicultura de la Universidad de Santiago de Compostela destinadas al cultivo y m 8 antenimi 105b ento de moluscos bivalvos. Se utilizaron semillas de dos especies, O.edulis y T.decussatus, con un tamaño de lava comprendido entre 5-7 mm (aproximadamente 8 meses de edad) que fueron suministradas por el Centro de Cultivos Mariños de Ribadeo (Lugo) y por el Centro de Experimentación en Acuicultura de Couso (A Coruña), pertenecientes a la Red de Centros de Investigación Mariña de la Consellería de Pesca e Asuntos Marítimos de la Xunta de Galicia. Las semillas se mantuvieron a lo largo de los estudios en tanques de 60 litros con agua de mar natural, a una temperatura constante de 15 +- 3ºC y con aireación controlada. El alimento consistió en una mezcla formada en igual proporción por cinco especies de microalgas y la contaminación experimental se realizó con distintos aislados de cooquistes purificados de C.parvum. Se evaluó la supervivencia de ooquistes de C.parvum captados por las dos especies de moluscos bivalvos anteriormente citadas, comprobadose un fuerte descenso de la viabilidad ooquística durante los cuatro primeros días del estudio (97% vs 30%). A partir del día cuatro y hasta el día 10 post-contaminación, la pérdida de la viabilidad ooquística fue progresiva, hasta alcanzar el último día del ensayo valores del 12% y 18% paralos ooquistes retenidos por las semillas de almeja y ostra, respectivamente. La inoculación intragástrica de los sedimentos obtenidos de semillas de almeja y de ostra el día 10 post-contaminación a dos camadas de ratones recién nacidos Swiss CD-1, reveló que todos los animales inoculados estaban infectados a los siete días post-inoculación. De igual forma, se comprobó el mantenimiento de la infectividad ooquística a los 31 días post-contaminación. Mediante exámenes histológicos se estudió el tránsito de ooquistes de C.parvum a través de semillas de almeja T.decussatus. Durante los 10 días que duró el ensayo, se visualizaron ooquistes en el intestino: a las 24 horas se cuantificaron más de 10 ooquistes por campo microscópico 40x y en varias ocasiones durante el experimento se observaron entre 5 y 10 ooquistes (días 2,4,6,7 y 10 post-contaminación). En las branquias también se detectaron ooquistes, desde el día 2 hasta el día 8 post-contaminación consecutivamente y siempre en un número no superior a 5 ooquistes por campo microscópico 40x. En este tejido, los ooquistes se localizaron tanto en los espacios interfilamentarse como en el mucus branquial. En menor media, los ooquistes de C.parvum se encontraron en el estómago, en los sifones y en el hepatopáncreas. En ningún momento del estudio se observó, mediante las técnicas utilizadas, que las formas parasitarias fuesen internalizadas por células del molusco, manteniéndose los ooquistes libres o mezclados con los contenidos estomacal y/o intestinal, sin atravesar los epitelios branquial y/o gastrointestinal. Por otra parte, se evaluó la liberación de ooquistes de C.parvum a partir de semillas vivas y muertas y su posterior captación por semillas de distinta especie. Cuando se estudió la transmisión de ooquistes entre especies coexistentes vivas, se observó en la especie receptora una disminución en el número de formas parasitarias y un mantenimiento de la viabilidad ooquistes como en su viabilidad en las especie de molusco receptora, hasta su desaparición antes de finalizar el estudio. Habiendo comprobado que los moluscos bivalvos representan una potencial fuente de infección humana por Cryptosporidium y siendo los mejillones al vapor un plato típico en ciertos países, finalmente se estudió, de forma experimental, si este método culinario inactiva las formas infectantes del parásito. Los resultados obtenidos en ratones lactantes demostraron que el empleo de vapor no elimina totalmente la capacidad infectante de los ooquistes de C.parvum
