BIOTECNOLOGIA DE PRODUCTOS NATURALES

Autor: MARTINEZ ARTEAGA BASELGA ROCIO.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA CSIC.
Centro de realización: CENTRONACIONAL DE BIOTECNOLOGIA CSIC (UAM).

Resumen: Hemos demostrado cómo la parada en la transcripción de uno de los componentes del grupo dcw (ftsZ) provoca efectos fisiológicos: además de no dividirse, las células pierden la viabilidad. FtsZ es una proteína esencial para la división en Escherichia coli. La ausencia de esta proteína provoca la filamentación, ya que las células crecen pero no son capaces de dividirse. En la ausencia de FtsZ, los filamentos pierden la viabilidad en un periodo de tiempo de dos horas. La viabilidad se recupera cuando los niveles de FtsZ se restauran a los valores iniciales presentes en la estirpe parental. El empleo de matrices génicas nos ha permitido analizar el patrón de expresión génica global en tres condiciones diferentes; expresando ftsZ, en ausencia de su expresión y al restaurarla. Los niveles de tránscrito del grupo de genes ribosomales muestran una notable disminución al producirse la parada en la expresión del gen ftsZ y durante el periodo de restauración no se recuperan. Durante el periodo de restauración de la expresión del gen ftsZ, aumentan los niveles de tránscrito de los genes de respuesta a daño a DNA y también genes involucrados en el metabolismo biosintético (anabolismo de nucleótidos, aminoácidos y metabolismo central intermediario). Para validar los resultados obtenidos de las matrices génicas se cuantificaron los niveles de tránscrito de algunos genes relevantes (p.ej.: ftsZ, clpP, uvrC) mediante RT-PCR. La cuantificación de los niveles de tránscrito de dichos genes corroboró en gran medida los resultados obtenidos mediante las matrices génicas. La respuesta transcripcional observada sugiere posibles mecanismos que la célula adopta para adaptarse para vivir en ausencia de división y cómo pueden influir sobre las medidas de viables que incluyen la dilución de los cultivos. Una vez comprobado que la parada en la división provoca una respuesta en la transcripción global, investigamos el efecto contrario, es decir si los cambios en las condiciones fisiológicas producen un efecto sobre los niveles de tránscrito del grupo dcw, el mayor grupo de genes de división y síntesis de peptidoglicano. Se analizaron los niveles de tránscrito de los genes del grupo dcw mediante RT-PCR para comprobar si las condiciones fisiológicas afectan a la expresión de dichos genes. La expresión de los genes del grupo dcw se encuentra afectada por las condiciones fisiológicas, de manera que al crecer de forma exponencial los cultivos, es mayor en medio rico que en medio pobre. Estos resultados demuestran que la velocidad de crecimiento produce un efecto sobre los niveles de tránscrito del grupo dcw.

Autor: PALOMINO DEL CASTILLO CARMEN.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA - CSIC.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: Streptomyces lividans es una bacteria Gram positiva que secreta gran cantidad de enzimas extracelulares (Gilbert y col., 1995). Esta bacteria ha sido utilizada como sistema anfitrión para la producción de proteínas recombinantes (Gilbert y col., 1995), no obstante, tanto la consecución como la mejora de la producción de estas proteínas, algunas de ellas de aplicación industrial, requiere un estudio detallado e identificación de cuellos de botella de los mecanismos implicados en la secreción de proteínas extracelulares en Strptomyces. El mecanismo de transporte general de proteínas (sec) comienza con el reconocimiento e interacción de la maquinaria intracelular con las secuencias aminoterminales de las proteínas de secreción. Dos rutas principales diferentes se han descrito en las bacterias, por una parte, el mecanismo mediado por SecA/B que dirige proteínas de secreción a la membrana de forma postraducional (Beck y col., 2000) y por otra parte, el mecanismo mediado por la maquinaria SRP, formado por Ffh y scRNA y su receptor FtsY, que dirigen proteínas a la membrana al comienzo de su síntesis para su translocación a través del canal de membrana o translocón, siendo muchas de estas proteínas integrales de membrana como en el caso de E.coli (Dalvey y Chan, 2005). No se han encontrado genes homólogos a SecB en Streptomyces lividans, pero sí están presentes, los genes de la maquinaria SRP, ffh, scRNA y ftsY (Palacín y col., 2003). Ffh y el scRNA constituyen la SRP de S.lividans (Palación y col., 2003). Con este trabajo, hemos detectado un completo formado por Ffh, FtsY y proteínas modelo de secreción, alpha-amilasa y agarasa, en el citoplasma celular del mutante para la pepetidasa señal mayoritariamente (Y62) (Palomino y Mellado, 2005), donde el patrón de secreción está disminuido (Palación y col., 2002), indicando que la SRP está implicada en el mecanismo de secreción de esta bacteria. Además, se ha observado que el mutante Y62 tiene un efecto sobre los niveles de Ffh y FtsY en membrana, ya que ambos componentes aumentan, encontrándose en forma de ocmplejos constituidos por Ffh, FtsY y la preproteína pre-alpha amilasa. Gracias a la miscroscopía de inmunofluorescencia hemos podido observar la localización de los componentes SRP distribuidos en sitios concretos de las hifas del mutante Y62 frente a la cepa silvestre de distribución difusa. Esta localización recuerda a la localización microscópica específica del translocón unido a GFP. Se ha descrito un fenómeno de acumulación de intermediarios formados por Ffh, su receptor y preproteínas, en la membrana del retículo endoplásmico de células eucariotas cuando no existen transolocón disponibles (song y col., 2000). Una situación similar puede que esté ocurriendo en S.lividans en ausencia de la peptidasa señal mayoritaria, donde el procesamiento del péptido líder ocurre de forma ineficaz pudiendo provocar un bloque temporal en el translocón. Por último, Ffh y FtsY unidos a pre-alpha amilasa que forman un complejo en membrana también están asociados a la ATPasa de membrana SecA, indicando que las proteínas que son transportadas a la membrana por SRP necesitarían de la acción de SecA para su translocación.