FISICA MOLECULAR

Autor: PÉREZ RUIZ RAÚL.
Año: 2006.
Universidad: POLITÉCNICA DE VALENCIA [Más tesis de esta universidad] [www.upv.es].
Centro de lectura: U.P.Valencia ( Dep. Quimica).
Centro de realización: Universidad Politécnica de Valencia.

Resumen: La ciclorreversión (CR) oxidativa ó reductiva de oxetanos por transferencia electrónica fotoinducida (TEF), no ha sido estudiada en profundidad, a pesar de que este proceso ha despertado un gran interés en la última década en relación con la exploración de nuevas rutas sintéticas y con la reparación fotoquímica del ADN. Respecto a la via fotooxidativa, teniendo en cuenta los cálculos teóricos y los datos experimentales ya publicados sobre su naturaleza se ha considerado interesante realizar un estudio experimental que aporte nuevos conocimientos acerca del mecanismo de reacción. En este contexto, se ha elegido como sustrato modelo el trans,trans-2-ciclopropil-3-fenil-4-metiloxetano (1) que ha permitido aclarar aspectos mecanísticos de la CR oxidativa de oxetanos. La escisión de 1 por ruptura inicial del enlace C2-C3 da lugar a los compuestos utilizados en la fotocicloadición de Patero-Büchi para la síntesis de 1. Por el contrario, la formación de un fotoproducto nuevo debido a la captura nucleofílica intermolecular del intermedio resultante de la fragmentación al enlace O-C2 por acetonitrilo está de acuerdo con un mecanismo por pasos. Respecto a la via fotorreductiva, se ha estudiado la CR del sustrato modelo trans,trans-2-(4-cianofenil)-3-fenil-4-metiloxetano (4) usando el 1-metoxinaftaleno como fotosensibilizador. Los datos experimentales son consistentes con que la reacción tiene lugar desde el estado singlete del sensibilizador. La fragmentación del anión radical de 4 ocurre por ruptura de los enlaces O-C2 y C3-C4 dando lugar a productos (acetaldehído y 4-cianoestilbeno) diferentes a los usados para la síntesis de 4 por medio de la fotociloadición de Paterno-Büchi. El proceso transcurre a través del anión radical del trans-4-cianoestilbeno, que se ha detectado mediante FDL (?max = 500 nm).

Autor: MANOJAS VASTFSÓN MARIA.
Año: 2006.
Universidad: BARCELONA [Más tesis de esta universidad] [www.ub.es].
Centro de realización: FACULTAD DE FÍSICA.

Resumen: El trabajo realizado en esta tesis se basa en el estudio del plegamiento y desplegamiento mecánico en moléculas de ARN. El objetivo principal es desarrollar modelos fenomenólicos que sean útiles para interpretar los resutlados de los experimentos de moléculas individuales las pinzas ópticas. Nuestra estratégica es modelizar tanto la molécula de ARN como lso diferentes elementos involucrados en los experimentos, para extraer información termodinámica y cinética del proceso de plegamiento y desplegamiento en ARN.

Autor: MORENO GONZÁLEZ M. CARMEN.
Año: 2006.
Universidad: GIRONA [Más tesis de esta universidad] [www.udg.es].
Centro de lectura: ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR IV.
Centro de realización: UNVIERSITAT DE GIRONA.

Resumen: En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha realizado varias prospecciones en búsqueda de nuevos agentes de biocontrol efectivos en el control de enfermedades poscosecha. En una de ellas se aisló la cepa EPS125, que mostró elevada eficacia de biocontrol del patógeno fúngico Penicillium expansum, causante de la podredumbre azul y de grandes pérdidas económicas en poscosecha de fruta. Esta cepa también mostró ser efectiva frente a un amplio espectro de patógenos fúngicos de poscosecha como Botrytis cinerea, Monilinia laxa y Rhizopus stolonnifer y en una gran variedad de frutos. Debido a su alta eficacia, se planteó desarrollar esta cepa comercialmente, no obstante, para poder lograr este objetivo se debe llevar a cabo una exhaustiva caracterización del producto a nivel de identificación, producción en masa, formulación, mecanismos de biocontrol y trazabilidad. Hasta el momento, aspectos como la producción en masa y formulación de la cepa EPS125 han sido desarrollados con éxito. También, aproximaciones sobre el mecanismo de biocontrol de dicha cepa han sido realizadas, en donde la exclusión preventiva del patógeno por colonización del nicho y la interacción directa con las esporas fúngicas y tubos germinativos parecen tener un papel clave en el biocontrol. En el presente trabajo se planteó como objetivo complementar la información necesaria para el futuro registro del biopesticida EPS125, el cuál se pude desglosar con: 1 ,- Identificación y caracterización de la cepa EPS125 a través de pruebas fenotípicas y genotípicas. 2,- Desarrollo de un método de trazabilidad para la cepa EPS125 a través de marcadores moleculares específicos. 3,- Determinación del mecanismo de biocontrol utilizado por la cepa EPS125 contra P.expansum a través de aproximaciones fenotípicas y estudios genotípicos. De acuerdo con los resultado sostenidos en las pruebas morfológicas y bioquímicas, API 20E, perfiles Biolog y de ácidos grasos, y secuenciación del gen 16S rDNA, la cepa EPS125 se incluye dentro de la especie Pantowea agglomerans (Enterobacter agglomerans-Ervinia herbicola). Esta cepa mostró rasgos característicos que la diferenciaban de otras especies, e incluso de peas de la misma especie. En concreto, a diferencia del resto de cepas analizadas, la cepa EPS125 fue incapaz de utilizar como fuente de carbono tween 40, pero por el contrario fue la única capaz de metabolizar mono-metil succinato. Además, en relación al perfil de ácidos grasos celulares mostrados por la cepa EPS125, ésta también fue la única que mostró los ácidos grasos 14:1 w5c, SIF1 y 15:0 ISO 3OH. En relación con la caracterización genotípica, la cepa EPS125 mostró un polimorfismo en la longitud de los fragmentos de macrorestricción genómica MRFLP peculiar compuesto por 13 fragmentos (302,270,259,253,197,179,165,160,140,110,81 y 71 Kb) a partir de la digestión del DNA con XbaI. Dos marcadores moleculares de DNA específicos (125.2 y 125.3) para la cepa EPS125 han sido desarrollados en el presente trabajo. Cada marcador molecular mostró ser semiespecífico para su detección mediante la técnica de PCR cuando fueron usados por separado amplificando cinco cepas de P.agglomernas con el conjunto de cebadores 125.2 y una cepa de la misma especie con el conjunto de cebadores 125.3 de un total de 267 cepas analizadas (257 cepas de la especie P.agglomerans y 10 cepas de otros géneros). Pero, a diferencia del resto de bacterias analizadas, la cepas EPS125 fue la única que mostró señal de amplificación con ambos conjuntos de cebadores. Este resultado sugiere, el posible uso combinado de los dos marcadores moleculares para estudios de trazabilidad de la cepa EPS 125 en una reacción mutiplex PCR. P.agglomerans EPS125 presenta las características adecuadas para un potencial biopesticida comercial como la ausencia de vida nucleadora de hielo, así como también inocuidad en plantas. Además de los ensayos en planta, esta cepa tam 8 bién mos 1ff8 tró esencia de toxicidad en mamíferos como es deseable. La efectividad del agente de biocontrol P.agglomerans EPS125 para inhibir P.expansum fue determinada mediante ensayos de dosis-respuesta, a partir de los que se obtuvieron parámetros de eficiencia. Concretamente, siguiendo el modelo de saturación hiperbólica la cepa EPS125 fue altamente efectiva contra P.expansum en manzana mostrando una dosis efectiva mediante de 2.7x10(5) a 7x10(5) ufc/ml, y una ratio de 25-101 células de EPS125 para inactivar una espora. El estudio del mecanismo de biocontrol empleado por P.agglomerans en el control de P.expansum se llevó a cabo mediante aproximaciones fenotípicas y estudios genéticos basados en la utilización de la técnica de mutagénesis con transposones. De acuerdo con los resultados obtenidos en la caracterización fenotípica, la producción de metabolitos antifúngicos así como también la competencia por nutriente no parecen ser los mecanismos principales responsables de la capacidad inhibitoria de la cepa EPS125. Por el contrario, una interacción directa entre células del agente de biocontrol y esporas del patógeno es requerida para lograr la inhibición de la germinación de las esporas de EP.exampsum y su consecuente infección. Observaciones realizadas obre cultivos de P.agglomerans EPS125 crecidos en jugo de manzana muestran además de una gran cantidad de filamentos semejantes a pili de tipo IV interconectando células, agrupaciones multicelulares o "symplasmata" envueltas por una capa de alginato. Estas observaciones parecen indicar que tanto los filamentos, los cuáles podrían ser responsables del movimiento tipo "twitching" desembocando en la formación de microcolonias, como la glinato, la producción del cuál está influida por las condiciones de crecimiento, podrían intervenir en los primeros estadios de formación del tapete microbiano o biofilm por parte de P.agglomerans EPS125, así como también jugar un papel clave en la inhibición de la germinación de las esporas del patógeno. Para demostrar realmente qué mecanismo es responsable de la actividad biocontrolador de P.agglomerans EPS125 se recurrió al análisis genético de mutantes defectivos en biocontrol de P.expansum en manzana obtenidos mediante mutagénesis aleatoria con el minitransposón GUS (mTn5SSgusA40). De este modo, 7 mutantes completamente defectivos en biocontrol de la podredumbre azul (m40, m439, m622, m1212, m2002, m2126 y m4015() fueron seleccionados de un total de 4032 mutantes no auxotróficos. Dichois mutantes mostraron la misma morfología colonial sobre medio mínimo ABM; curvas de crecimiento en medio LB líquido, capacita de multiplicación en manaza a 13 y 23ºC, señales moleculares de quorum sensing, y producción cualitativa de alginato. Diferencias fenotípicas respecto la cepa silvestre únicamente fueron observadas en los mutantes m2126 y m4015 en relación con la producción de filamentos mediante análisis con microscopio electrónico de rastreo. Respecto al análisis a nivel de secuencia de ADN, éste sólo se logró en los mutantes m40, m2002, m2126 y m4015. Se obtuvo la secuencia nucleotídica flanqueante al minitransposón del mutante m40 y la proteína hipotética deducida in silico mostró un 35% de identidad con secuencias de maino ácidos de la proteína dihidrodipicolinato sintas DHDPS de diferentes bacterias. DHDPS es una enzima clave en la ruta de biosíntesis del meso-diaminopimelato (meso-DAP) en bacterias y plantas, el cuál es un constituyente indispensable dela pared de peptidoglicano bacteriana y repercusores directo de la lisina. Debido que le mutante m40 no es auxótrofo para la lisina y posee la ruta biosintética del DAP inalterada siendo capaz de crecer en medio mínimo; posee tres transposones insertados en su genoma; y la secuencia nucleítidca flanqueante al transposon no mostró similitud con ninguna secuencia actualmente depositada en la base de datos del GEnBank, descartan a este mutante como candidato a tener en cuenta en el presente trabajo. Las proteínas hipotéticas deducidas a partir de la secuencia nucleotídica del mutante m2126 de 876 hasta 1392 by de 48 hasta 753 b compartió similitud con una proteína hipotética de función desconocida de Comamonas sp 33% y con proteínas de la familia de la luciferasa bacteriana 55% respectivamente. De acuerdo con la bibliografia y los resultados descritos en el presente trabajo, todo parece indicar que la mutacion producida en el mutante m2126 podría haber alterado una luciferasa FMN-dependiente (LuxAB) relacionada con el sistema de regulación génica vía quorum sensing afectando posiblemente la producción de los filamentos semejantes a los pili de tipo IV y la consiguiente formación de biofilm. Las secuencias proteica deducida a partir del mutante m4015 mostró un 41% de identidad con lisina/ornitina N-monoxigenasas implicadas en la ruta biosintética de sideróforos del tipo aerobactina. Se sospecha que la inserción del transposón en el mutante m4015 ha podido alterar la capacidad de este elemento a P.expasum, el cuál es indispensable para indicar el proceso de germinación de las esporas. Finalmente, la secuencia nucleotídica de los mutantes m2002 y m4015 mostró un 90% de identidad con secuencias de inserción IS1222, las cuáles mediante translocaciones y delecciones contribuyen en procesos de flexibilidad genética ya adaptación al medio. A pesar que ambas secuencias nucleotídicas fueron idénticas, el punto de inserción del tranposón en los dos mutantes fue distinto debido a que los patrones obtenidos en el southern y las características fonotípicas de los dos mutantes no coincidieron. Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten crear un modelo hipotético de formación de biofilm en P.agglomerans EPS125, en donde está involucrada la inhibición de la germinación de las esporas del patógeno. En primer lugar, las células antagonistas se adhieren a la superficie de la herida de la manzana mediante una variedad de componentes celulares como filamentos semejantes a pilil de tipo IV algianto. Estos filamentos de tipo piloso se podrían unir a diferentes superficies incluyendo otras célula sbacterianas y esporas del patógeno prudiciendo movilidad de tipo "twitching" mediante polimerización y retracción de los filamentos pilosos. Este movimiento acerca las células facilitando la formación de aglomerados mutlicelulares, y finalmente microcolonias en donde se incluirían las esporas del patógeno. Paralelamente, la adhesión inicial de las células antagonistas es seguida por la producción de polsiacáridos extracelulares de l tipo alginato, la cuál es inducida únicamente en ciertas condiciones. Además, las células EPS125 podrían ser capaces de captar hierro de medio a través de siderófors disminuyendo su disponibilidad a las células patógenas y evitando su proceso de germinación. Entonces, el microambiente formado por la cepa EPS125 podría disminuir la disponibilidad de diferentes compuestos como agua, hierro u oxígeno que son indispensables para la germinación de conocidas de P.expansum. Además, la cepa EPS125 produce moléculas HSL implicadas en la regulación vía quorum sensing de genes que podrían ser responsables de la diferenciación del biofilm y de su actividad biocontroladora. En concreto, podría estar directamente relacionado en la formación de filamentos pilosos importantes en el proceso de diferenciación de los tapetes microbianos, y en otros mecanismos de biocontrol desconocidos empleados por el agente de biocontrol. Resumiendo, le biofilm formado por P.agglomerans EPS125 proporciona un entorno apropiado para su crecimiento, su estructura física permite resistir estreses ambientales e inhibe la infección causada por P.expansum privando a las esporas de componentes indispensables como agua. Oxígeno o hierro, los cuáles disparan el proceso de germinación. En conclusión, los resultados expuestos en el presente trabajo amplían el conocimiento sobre el comportamiento de P.agglomerans en su ambiente natural y refuerzan la idoneidad de esta etapa como un interesante biopersticida para ser desarrollado comercialmente.