AMINOACIDOS

Autor: ROMERO ARAUZ ANA MARIA.
Año: 2003.
Universidad: EXTREMADURA [www.unex.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA.

Resumen: Las nucleótido-pirofosfatasas/fosfodiesterasas (NPP/PDE) son enzimas que hidrolizan derivados fosfoanhídrido y fosfodiéster de nucleósido 5'-monofosfatos (NMP), dando como producto. Son ectoenzimas de membranas que pueden presentar también formas solubres. Su función biológica no se conoce con exactitud, aunque se les atribuyen diveros papeles fisiológicos y patogénicos relacionados con el recambio extracelular de derivados nucleotídicos, generación de pirofosfato extracelular, inhibición de la autofosforilación del receptor de insulina y aspectos de la motilidad e invasividad de células tumorales. No se conocen mecanismos fisiológicos de regulación de la actividad enzimática de las NPP/PDE. En esta tesis se ha investigado el efecto que producen los aminoácidos sobre la inactivación de la NPP/PDE de hígado de rata por bajas concentraciones del quelante de metales EDTA, que resultó ser un proceso dependiente del tiempo, bloqueado por el sustrato-4-nitrofenil-dMTP. La inactivación siguio una cinética de primer orden respecto a la concentración de NPP/PDE activa. Medidas de la actividad enzimática residual permitieron calcular la constante cinética aparente de inactivación (ki(ap)). La sensibilidad al EDTA se ha empleado como una forma de sondear la conformación de la enzima. El efecto del EDTA fue potenciado por alfa-aminoácidos libres a concentraciones que, en ausencia del quelante, no afectaban a la actividad enzimática. Todos los aminoácidos probados actuaron como aceleradores de la inactivación por EDTA, aunque lo hicieron con distintas eficacia, estimadas en forma de factores de aceleración (cociente de los valores de Ki(ap) obtenidos en presencia y en ausencia de aminoácido) o de incrementos (porcentajes de aumento del valor de ki(ap)). Experimentos hechos con compuestos cuya estructura difería de los alfa-aminoácidos en diversos aspectos indicaron que la presencia de los grupos alfa-amino y alfa-carboxilo, así como la distancia entre ellos, son elementos esenciales para el efecto observado. Los alfa-aminoácidos pueden actuar sobre la NPP/PDE en condiciones fisiológicas, pues lo hicieron (i) en forma de mezclas de amoniácidos prepradas en proporcione sy a una concentración total similares a las que existen en la sangre en condiciones de ayuno (ii) a pH fisiológico y (iii) sobre la NPP/PDE integrada en preparaciones crudas de membranas hepáticas. Los resultados se interpretan como manifestación de una interacción directa aminoácidos-enzima que produce un cambio de conformación de la proteína. Estudios de correlación, entre la estructura de los compuestos probados y su actividad, indican que dicha interacción se establece mediante múltiples elementos estructurales, entre los cuales debe incluirse la unión del aminoácido a iones metálicos (posiblemente Zn2+) ligados a la enzima. El cambio de conformación producido por la unión a alfa-aminoácidos podría tener significado en relación con acciones de las NPP/PDE que no dependean de su actividad catalítica sino de interacciones proteína-proteína, como es el caso conocido de la interacción de una NPP/PDE con el receptor de insulina.

Autor: ROMERO ARAUZ ANA M..
Año: 2003.
Universidad: EXTREMADURA [www.unex.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA.

Resumen: Las nucleótido-pirofosfatasas/fosfodiesterasas (NPP/PDE) son enzimas que hidrolizan derivados fosfoanhídrido y fosfodiéster de nucleósido 5'-monofosfatos (NMP), dando como producto. Son ectoenzimas de membranas que pueden presentar también formas solubres. Su función biológica no se conoce con exactitud, aunque se les atribuyen diveros papeles fisiológicos y patogénicos relacionados con el recambio extracelular de derivados nucleotídicos, generación de pirofosfato extracelular, inhibición de la autofosforilación del receptor de insulina y aspectos de la motilidad e invasividad de células tumorales. No se conocen mecanismos fisiológicos de regulación de la actividad enzimática de las NPP/PDE. En esta tesis se ha investigado el efecto que producen los aminoácidos sobre la inactivación de la NPP/PDE de hígado de rata por bajas concentraciones del quelante de metales EDTA, que resultó ser un proceso dependiente del tiempo, bloqueado por el sustrato-4-nitrofenil-dMTP. La inactivación siguio una cinética de primer orden respecto a la concentración de NPP/PDE activa. Medidas de la actividad enzimática residual permitieron calcular la constante cinética aparente de inactivación (ki(ap)). La sensibilidad al EDTA se ha empleado como una forma de sondear la conformación de la enzima. El efecto del EDTA fue potenciado por alfa-aminoácidos libres a concentraciones que, en ausencia del quelante, no afectaban a la actividad enzimática. Todos los aminoácidos probados actuaron como aceleradores de la inactivación por EDTA, aunque lo hicieron con distintas eficacia, estimadas en forma de factores de aceleración (cociente de los valores de Ki(ap) obtenidos en presencia y en ausencia de aminoácido) o de incrementos (porcentajes de aumento del valor de ki(ap)). Experimentos hechos con compuestos cuya estructura difería de los alfa-aminoácidos en diversos aspectos indicaron que la presencia de los grupos alfa-amino y alfa-carboxilo, así como la distancia entre ellos, son elementos esenciales para el efecto observado. Los alfa-aminoácidos pueden actuar sobre la NPP/PDE en condiciones fisiológicas, pues lo hicieron (i) en forma de mezclas de amoniácidos prepradas en proporcione sy a una concentración total similares a las que existen en la sangre en condiciones de ayuno (ii) a pH fisiológico y (iii) sobre la NPP/PDE integrada en preparaciones crudas de membranas hepáticas. Los resultados se interpretan como manifestación de una interacción directa aminoácidos-enzima que produce un cambio de conformación de la proteína. Estudios de correlación, entre la estructura de los compuestos probados y su actividad, indican que dicha interacción se establece mediante múltiples elementos estructurales, entre los cuales debe incluirse la unión del aminoácido a iones metálicos (posiblemente Zn2+) ligados a la enzima. El cambio de conformación producido por la unión a alfa-aminoácidos podría tener significado en relación con acciones de las NPP/PDE que no dependean de su actividad catalítica sino de interacciones proteína-proteína, como es el caso conocido de la interacción de una NPP/PDE con el receptor de insulina.

Autor: LASA VENTURA MARTA.
Año: 2004.
Universidad: ZARAGOZA [www.unizar.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo se han estudiado los análogos de fenilalanina trans-c6Phe, cis-c5Phe y trans-c5Phe, que presentan como restricción un puente alquilideno (de cuatro y tres carbonos, respectivamente) entre los carbonos a y b. Se han desarrollado rutas sintéticas de los aminoácidos que permiten obtenerlos como pares racémicos en escala de varios gramos de forma competitiva. En el caso de trans-c6Phe, se estudió una ruta basada en la reacción de Diels-Alder y otra en la de Strecker, resultando esta última más favorable. Para los análogos ciclopentánicos se consideró un esquema sintético que incluía una reacción de ciclación y otro basado en la reacción de Strecker, siendo nuevamente ésta la elegida: se trata de una síntesis estereodivergente de cis-c5Phe y trans-c5Phe, con rendimientos comparables y competitivos.Las síntesis racémicas de los aminoácidos se completaron con las resoluciones de los mismos empleando cromatografía líquida de alta resolución sobre fases estacionarias quirales derivadas de polisacáridos. Aplicando esta metodología en escala semipreparativa, obtuvimos cada uno de los enantiómeros de los pares de trans-c6Phe y c5Phe en forma pura y determinamos sus configuraciones. De esta manera se describe una nueva síntesis de los enantiómeros de trans-c6Phe, y la primera ruta que permite obtener los estereoisómeros de c5Phe.Los distintos aminoácidos racémicos fueron incorporados a dipéptidos modelo de fórmula R-(S)-Pro-cnPhe-NHR'. Se realizó el estudio estructural mediante difracción de rayos X de péptidos de cada par de diastereoisómeros, de forma que se pudieron establecer las configuraciones de los centros estereogénicos de todos ellos. Dichos péptidos, en el caso de c5Phe, se sintetizaron también a partir de los aminoácidos enantiopuros, siendo éste el método de asignación de las configuraciones de los enantiómeros anteriormente resueltos.Otra aplicación estudiada fue el empleo de aminoácidos restringidos, entre ellos un derivado de (R,S)-c6Phe, como ligandos aminoacidato para la síntesis de complejos organometálicos de rutenio. Se sintetizaron diferentes complejos, cuyas estructuras fueron estudiadas mediante diversas técnicas (medidas de resonancia magnética nuclear, rayos X, dicroísmo circular) y también se comprobó que se comportan como catalizadores activos en procesos asimétricos de transferencia de hidrógeno de 2-propanol a acetofenona.

Autor: TORRE FAZIO FERNANDO NICOLÁS DE LA.
Año: 2005.
Universidad: MÁLAGA [www.uma.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.

Resumen: El nitrógeno es uno de los principales factores que limitan el crecimiento y desarrollo de las plantas. Los mecanismos por los que este elemento es incorporado, asimilado y metalizado han sido ampliamente estudiados en plantas herbáceas como Arabidopsis thalian u Oryza sativa, sin embargo, los estudios llevados a cabo en árboles y especialmente en coníferas han sido mucho más limitados. Los resultados previos generados por el grupo dirigido por el Dr. Francisco M. Cánovas Ramos han resultado en un enorme avance en el metabolismo del nitrógeno en las coníferas del género Pinus (pino)llevando a cabo caracterización de los principales genes implicados en la asimilación del amonio: GS1a, GS1b, IDH, FdGOGAT, etc. Estos estudios han sido abordados desde diferentes estrategias como expresión a nivel de mensajeros o polipéptidos, análisis de localización tipo-celular, obtención de plantas transgénicas o la caracterización de sus regiones promotoras. En esta tesis se ha procedido como estrategia general a la caracterización molecular, estructural y cinética de enzimas clave en el metabolismo del nitrógeno en coníferas. Se han generado proteínas recombinantes en E.coli a partir de las secuencias codificantes disponibles en nuestro laboratorio para glutamina sintetasa (GS), asparragina sintetasa (AS) y aspartato aminotransferasa (AAT). Los resultados obtenidos, integrados con la información previamente disponible, han permitido proponer una función diferencial para la isoenzimas GS1a y GS1b de pino, de esta manera se propone el papel esencial de GS1a en la asimilación del amonio en tejidos fotosintéticos y el de GS1b manteniendo un flujo constante de glutamina, destinada al transporte y almacenaje, a concentraciones variables de glutamato. Por otro lado, la caracterización de la familia génica de las AATs en pino ha permitido describir la existencia en plantas de un nuevo gen codificante para est enzima. Este gen se encuentra filogenéticametne más próximo a los genes que codifican las AATs en cianobacterias y arqueobacterias que a los genes que codifican estas proteínas previamente descritos en plantas. Los datos de comparación de secuencia, filogenéticos, las características moleculares, los parámetros cinéticos y estructurales, los patrones de expresión así como la localización subcelular sugieren que el papel fisiológico de esta enzima es la conversión de glutamato en aspartato para la biosíntesis de los aminoácidos lisina, isoleucina, treonina y metionina. Los análisis filogenéticos realizados indican que los genes codificantes para las enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de los aminoácidos metionina, lisina isoleucina y treonina tienen origen endosimbiótico y fueron adquiridos por las plantas a partir de un ancestro de las cianobacerias. El origen endosimbiótico de esta ruta podría ser el motivo por el que estos aminoácidos tienen el carácter de esencial para los animales y que obliga a su adquisición mediante la dieta.