BIOQUIMICA FISICA

Autor: DÍAZ MORENO IRENE.
Año: 2004.
Universidad: SEVILLA [www.us.es].
Centro de lectura: CENTRO DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS ISLA DE LA CARTUJA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOQUÍMICA VEGETAL Y FOTOSÍNTESIS . UNIVERSIDAD DE SEVILLA CSIC..

Resumen: Las interacciones trasitorias entre biomoléculas se han convertido en el centro de la investigación de muchas áreas de la Bioquímica Moderna.La caracterización estructural continuada , utilizando cualquiera de las técnicas estructurales de alta resolución, es vital para comprender la función de este tipo de estos complejos. El trabajo de esta Tesis Doctoral se ha planteado con un doble objetivo.Por un lado , profundizar en el conocimiento acerca de las interaciones moleculares y la caracterización estructural de los complejos transitorios entre proteinas, teniendo como objetivo final la compresión de los factores que controlan la relación entre la estructura y la función de las proteínas, así como el modo de interacción y formación de este tipo de complejos inestables o débiles .Se ha hecho especial énfasis en aquellos rasgos que confieren a una proteina su capacidad para interaccionear especifica y transitoria con otras. El segundo objetivo supone un avance en el desarrollo y conocimiento de dos espectroscopias actualmente imprescindibles , para los estudios de interacción entre biomoléculas en disolución:la Resonancia Magnética Nuclear RMN y la absorción de Rayos X XAS.Este desarrollo tiene a su vez una doble vertiente : a nivel experimental , optimizando la calidad de los espectros de RMN y XAS en concentraciones límite.a nivel metodológico, aplicando , de manera pionera , la XAS al estudio de complejos entre biomoléculas y abordando , por primera vez, la carazterización estructural entre proteinas solubles y de membrana por NMR en disolución.

Autor: PERÁLVAREZ MARÍN ALEJANDRO.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: FACULTAT DE MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: La bacteriorodopsina (BR) es el sistema fotosintético más sencillo que se conoce, debido a que genera un gradiente electroquímico a partir de la energía de la luz, transportando protones a través de la membrana que es aprovechado por la ATP-sintasa para obtener energía, en condiciones de falta de oxígeno. Utilizando métodos de Biología Molecular para la mutagénesis de proteínas, combinado con estudios biofísicos, se determina como cambios puntuales en la secuencia proteica afectan a la estructura y función de la proteína. En este estudio nos hemos propuesto determinar el rol de las prolinas incluidas en las alfa-hélices B (Pro50), C(Pro91) y F (Pro186), además de las fuerzas e interacciones responsables de la situación y la forma distorsionada de la hélice C de la BR a la altura del motivo Thr90-Pro91. Esta hélice es clave en el mecanismo de transporte del protón, ya que contiene los dos residuos espártico (Asp85 y Asp96) que participan directamente en el transporte del protón. Los estudios biofísicos realizados permiten concluir que las Prolinas incluidas en las alfa-hélices transmembrana desempeñan principalmente un papel dinámico en la Bacteriorodospsina. Respecto al motivo Thr90-Pro91 en la Hélice C, destacar la importancia de este mecanismo para desarrollar una correcta función de transporte del protrón. Los resultados obtenidos para Bacteriorodopsina son extensibles a otras proteínas transmembrana.

Autor: LIDON MOYA MARIA DEL CARMEN.
Año: 2005.
Universidad: MIGUEL HERNÁNDEZ DE ELCHE [www.umh.es].
Centro de lectura: INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR.

Resumen: El objetivo principal del presente trabajo ha sido la determinación y caracterización de un compuesto con la capacidad de heterodimerizar con CA-C (dominio carboxilo terminal de la proteína de la cápsida del VIH-1), e impedir de esta manera el ensamblaje natural de la cápsida, y en consecuencia, la infectividad del virus del sida. Para ello, el trabajo se divide en tres capítulos. En el primer capítulo se ha llevado a cabo la caracterización termodinámica de CA-C, mediante la utilización de diversas técnicas biofísicas: fluorescencia, DC, FTIR, RMN, y cromatografía de exclusión por tamaño molecular, a diferentes condiciones de pH y temperatura, con el fin de describir la estabilidad de las formas monomérica y dimérica de CA-C, y caracterizar cualquier posible intermediario que pueda aparecer en la reacción de plegamiento-asociación de la proteína, así como para comprender los factores energéticos que gobiernan la dimerización. Los resultados indican que el equilibrio de desnaturalización térmica de CA-C se compone de tres transiciones térmicas reversibles e independientes: (i) la primera transición (Tm 307 K), que se observa por FTIR y RMN, supone la disociación del dímero de CA-C, dando lugar a un intermediario monomérico plegado; (ii) la segunda transición (Tm 325 K), observada por fluorescencia del ANS, anisotropía y DC en el ultravioleta cercano, implica el desplegamiento parcial del intermediario monomérico plegado; y, (iii) la tercera transición (Tm 332 K), que se observa por DC en el ultravioleta lejano, absorbancia, FTIR y RMN, conlleva el desplegamiento global del intermediario monomérico parcialmente plegado. Además, también se han determinado los parámetros termodinámicos de la disociación y desnaturalización de las formas dimérica y monomérica de CA-C a pH fisiológico. Se ha observado que CA-C, tanto en forma monomérica como dimérica, experimenta una transición conformacional a pH ácido, formando un glóbulo fundido, cuyas propiedades son similares a las que presenta el intermediario monomérico parcialmente plegado observado en el equilibrio de desnaturalización térmica de CA-C. En el segundo capítulo se ha llevado a cabo el diseño de un péptido (CAC1) que comprende la secuencia de la única hélice que forma la interfase de dimerización de CA-C ( -hélice 2), y se han estudiado tanto su estructura como sus propiedades de asociación a CA-C, mediante diversas técnicas biofísicas: fluorescencia, DC, RMN, cromatografía de exclusión por tamaño molecular, cromatografía de afinidad analítica, e ITC. Los experimentos de DC, cromatografía de exclusión por tamaño molecular, y RMN indican que CAC1 es capaz de interaccionar con CA-C. Además, mediante fluorescencia, cromatografía de afinidad analítica, e ITC, se ha determinado la constante de disociación aparente del heterocomplejo formado entre CAC1 y CA-C, que es del orden de 50 M, sólo cinco veces superior que la del dominio completo (10 M). Estos resultados indican que este péptido puede utilizarse como modelo para el diseño de un agente antiviral. Y en el tercer capítulo se ha llevado a cabo el diseño de proteínas basadas en la estructura de CA-C, pero de menor tamaño, que además de contener todas ellas la -hélice 2, también contienen otros residuos críticos para la dimerización. Estas miniproteínas se han generado mediante técnicas de ingeniería de proteínas, y se ha intentado llevar a cabo su expresión y purificación. Ninguna de las mutaciones diseñadas para la obtención de miniproteínas que sólo contuvieran hasta la segunda hélice de CA-C permitió la expresión de proteína; no obstante, se ha conseguido la expresión y puesta a punto del protocolo de purificación de un fragmento de CA-C que contiene los residuos 146-214 del dominio intacto, para la posterior realización de estudios biofísicos.

Autor: LEÓN MADRENAS XAVIER.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: FACULTAT DE MEDICINA.
Centro de realización: UNITAT DE BIOFÍSICA.

Autor: SOT SANZ JESÚS.
Año: 2005.
Universidad: PAÍS VASCO [www.ehu.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA.

Resumen: Con el fin de poder comprender mejor el fenómeno de los rafts y los efectos producidos por las ceramidas en la membrana celular, realizamos una serie de estudios biofísicos en vesículas modelo. En un principio estudiamos el efecto de la composición lipídica en la resistencia a la solubilización por Triton X-100 las principales causas de esta resistencia. Con este fin se analizaron el efecto del Triton X-100 en vesículas formadas principalmente por PC/SM/Ch. Se observó que es necesaria la presencia de esfingomielina (y no de otros esfingolípidos) y del colesterol para que se produzca una resistencia a la solubilización por Triton X-100 y que esta resistencia era mayor a 37ºC que a 4ºC, disminuyendo según aumentaba la proporción de PC. Este comportamiento no sólo estaba supeditado a la existencia de una fase liquido ordenada, ya que en proporciones similares de lípidos liquido ordenado, la interacción que se produce entre el grupo hidroxi del colesterol y el grupo arbonilo de la SM, incrementa la resistencia ala solubilización por Triton X-100. En las condiciones en las que se producía una solubilización parcial, los residuos no solubilizados presentaba una composición cercana a PC/SM/Ch (1:1:1), con lo cual no se puede estar seguro de que las membranas resistentes a los detergentes correspondan a estructuras preexistentes en la membrana o que sean el resultado de una solubilización parcial y posterior reesamblaje de las bicapas lipídicas. Continuando los experimentos de solubilización se procedió a buscar una mezcla lipídica sencilla que se comportase como los rafts, o sea que fuera resistente a la solubilización a bajas temperaturas, pasando a ser soluble al aumentar la temperatura, esto se consiguió con la muestra SM/Ser. Al observar la composición de los residuos resistentes a la solubilización se observo que están enriquecidos en Cer, además para que ocurriera esta resistencia era necesario un alto empaquetamiento de las cadenas hidrocarbonadas lipídicas, de manera que esta resistencia sólo se producía con cermidas de cadena larga y con fosfolípidos saturados. Utilizando DSC y de atenuación de fluorescencia, se observó que la existencia de una pequeña cantidad de Cer producía la aparición de unos dominios ordenados que aumentaban con la proporción de ceramida, además se estableció que la fusión de estos dominios concedía con el aumento de solubilización. Finalmente, se estudió el proceso de solubilización en GUVs de SM/Cer mediante la microscopia de fluorescencia observándose que en el proceso de solubilización el Triton X-100 actuaba de manera preferente sobre los dominios ricos en SM sin afectar de manera aparente los dominios ricos en ceramida. Los último que se estudió fueron los efectos que producían las ceramidas de cadena larga (Cer16) y corta (Cer6 y CEr2) en las membranas lipídicas. Mediante estudios de monocapas, se observó que tanto la Cer2 como la Cer6, se comportaban como anfifilos solubles, de manera que eran capaces de solubilizar monocapas y bicapas, aunque no conseguían solubilizar completamente la bicapa. Mediante otras técnicas (DSC, 31P-RMN, y difracción de rayos X), se estudió el efecto que producían estas ceramidas en la transición gel-fluido y lamelar-hexagonal de los fosfolípidos. Los resultados mostraron que existen dos tipos de interacción ceramida-fosfolípido, correspondientes a las ceramidas de cadena larga o corta. Pueden considerase representantes característicos de estas dos clases la Cer16 y la Cer2 respectivamente. La Cer16 se mezclaba poco con los fosfolípidos en fase gel, aunque se solubilizaba en fase fluida. Además, la transición lamelar-hexagonal. Por el contrario, la Cer2 se mezclaba bien con los fosfolípidos en fase gel, estabilizando la fase fluida. La Cer6 muestra propiedades intermedias.

Autor: CONTRERAS GÓMEZ FRANCESC-XABIER.
Año: 2005.
Universidad: PAÍS VASCO [www.ehu.es].

Resumen: En esta Tesis se han estudiado los cambios inducidos, tanto por la actividad esfingomielinasa como por las ceramidas, en la estructura y propiedades físicas de la membrana celular. Con este objetivo, se ha observado cómo el colesterol permite la degradación de la esfingomielinasa incluso a temperaturas inferiores a la temperatura de transición gel-fluido del esfingolípido, debido a la formación de fases líquido-ordenadas. Además, se ha observado cómo las ceramidas, ya generadas in situ por la esfingomielinasa, o ya añadidas externamente, inducen el movimiento trasnbicapa (flip-flop) de lípidos en membranas biológicas y membranas modelo. Finalmente, se describe cómo las ceramidas inhiben la actividad scramblasa de las membranas por un mecanismo independiente de la PKC, y localizan con la scramblasa en células apoptóticas.

Autor: LORIZATE NOGALES MAIER.
Año: 2005.
Universidad: PAÍS VASCO [www.ehu.es].
Centro de lectura: UNIVERSIDAD DEL PAIS VASCO.
Centro de realización: UNIDAD DE BIOFÍSICA (CENTRO MIXTO CSIC-UPV).

Resumen: En esta tesis se ha profundizado en el estudio de las regiones del ectodominio gp41 del VIH-1 que poseen capacidad para interaccionar con membranas. Específicamente se utilizaron el reconocimiento por anticuerpos como criterio para establecer los estados inmersos en membrana o en solución fisiológicamente relevantes. La secuencia dominio de interfase (preTM) que está adyacente a membrana, se estabiliza como oligoméricos en diferentes estadíos de la proteína en el virión. Además, el epítopo reconocido por el anticuerpo neutralizante 4E10 que se encuentra en dicha secuencia, reconocer el epítopo inmerso en membranas tipo rafts. Finalmente, se ha determinado que en el estadío nativo de la proteína gp41, el péptido de fusión y la secuencia nfipática y adyacente al dominio de interfase (preTM), AID, interaccionan y que esta interacción dotaría de cierta solubilidad este complejo, evitando así que en el proceso de fusión catalizado por gp41, secuencias que tienen tanta afinidad por las membranas no interaccionen con ella antes de ser activado el proceso. Además, esta interacción generaría una estructura no leicoidal en la región AID, estructura reconocida por el anticuerpo neutralizante 2F5.