BIOQUIMICA INMUNOLOGICA

Autor: JIMÉNEZ CALIANI ANTONIO JAVIER.
Año: 2004.
Universidad: SEVILLA [www.us.es].
Centro de lectura: FACULTAD MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Recientemente se ha abierto y descubierto un nuevo campo de estudio de la metatonina y su acción sobre el sistema inmune.Ampliando este estudio, decidimos investigar el papel que jugaría la melatonina sobre dos enfermedades autounmunes, la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico. La administración de melatonina en ratas , con artritis inducida pro colágeno resulto tener efectos perjudiciales por elevar los niveles de anticuerpos anti colágeno , elevó los niveles de citoquinas inflematorias 11-1 e 11-6 que contribuyen a la degradación y erotión del cartílago , no reduce los niveles de stress oxidativo UO y LPO y motrífica los niveles hormonales:Aumentando el cortisol y modificando la produción de mormonas sexuales. La administración de malatona en ratones MRL-lpr resulto tener efectos opuestos según el sexo en hembras , la administración de melatonina posee efectos beneficiosos porque reduce los niveles de autoantiguerpos y provoca un cambio del respuesta del tipo TH2 antinflamatiria en machos poseee efectos perjudiciales por tener una respuesta proinflamatoría con elevación de los niveles de autoanticuerpos la melatonina actúa en el LUPUS de modo directo a nivel celular y demodo indirecto sobre la producción de mormonas sexuales, seguramente a través de la GNRH.

Autor: ESTÉVEZ ALBEROLA M. CARMEN.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE QUÍMICAS.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICAS.

Resumen: La tesis presentada ha ido dirigida a la preparación de anticuerpos policlonales y MIPs (Polímeros de Huella Molecular) para el desarrollo de metodologías de análisis para la detección de contaminantes ambientales. Se han producido anticuerpos para el Nonilfenol, principal producto de degradación de los tensioactivos no iónicos poliretoxilados, con los que se ha desarrollado un ELISA con una detectabilidad de 2.3 ug/l. La naturaleza del analito y de los haptenos usados como competidores ha resultado clave para el desarrollo del ensayo con elevada reproducibilidad (especialmente debido a su lipofilia), de manera que ha sido necesario preparar antígenos de tapizado usando una macromolécular hidrofílica como el aminodextrano. Por otro lado, se han producido anticuerpos para los sulfofenilcarboxilatos (SPCs), productos de degradación de los LAS, OTRA familia de tensioactivos. Para ello se ha considerado una estrategia de inmunización heteróloga, basada en la mezcla de inoculación de compuestos. Se diseñaron dos haptenos distintos con los que se produjeron 3 familias de antisueros. Con cada familia se desarrolló un ELISa, by en cada caso se ha estudiado el efecto de hapteno de inmunización usado sobre la especificidad y sensibilidad de los mismos. Por otro lado se ha abierto una línea de trabajo dirigida a la preparación y evaluación de MIPs. Considerando como analito el Irgarol 1051, se ha puesto a punto una metodología de preparación del receptor así como de evaluación y caracterización del mismo, tanto como receptor molecular selectivo (mediante la determinación de la afinidad y la capacidad) y como fase de extracción selectiva.

Autor: CHACÓN FERNÁNDEZ PEDRO JOSÉ.
Año: 2004.
Universidad: SEVILLA [www.us.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Aunque la alergia es una enfermedad descrita en el hombre a principios del siglo XX, sus causas y mecanismos aún están en estudio. Desde hace años se conoce que las reacciones alérgicas o atópicas se originan, en los individuos que la sufren, como consecuencia de una reacción inmune "equivocada" frente a sustancias extrañas o alergenos y que están mediadas por inmunoglobulinas de tipo E sintetizadas contra estos alergenos (IgE). Esta IgE desempeña su función en la superficie de células inmunes efectoras (linfocitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos y neutrófilos). A ellas se une a través de receptores específicos (Fc epsilon RI, Fcepsilon RII y galectina-3), provocando la activación de las mismas, que se traduce en la liberación de mediadores inflamatorios. Los protaglandinas son mediadores liposolubles sintetizados por oxigenación del ácido araquidónico, por acción de los enzimas ciclooxigenasas (COXs). Existen dos tipos de COXs: la COX-1 es expresada de forma constitutiva en la mayoría de los tejidos y es la responsable de la generación de prostaglandinas que regulan condiciones fisiológicas normales (la secreción gástrica, por ejemplo); en cambio COX-2 no aparece expresada en condiciones normales en los tejidos, y puede ser inducidas en condiciones inflamatorias, de estrés, etc. Cada vez hay más datos que sugieren que la inducción de la COX-2 y la síntesis de prostaglandinas por la misma, puede ser un elemento clave en el estado fisiopatológico de un gran número de desórdenes, entre los que se encuentra la alergia. La IL-8 es una citoquina con capacidad proinflamatoria, debida a su principal función: es quimiotáctica (atrayente en función de gradiente químico) para células inmunes. Además presenta características angiogénicas y mitogénicas. Por esta razón se ha asociado c on un gran número de patologías que cursan con inflamación, como las reacciones alérgicas. En este estudio demostramos que linfocitos (T, B y NK) de sujetos alérgicos expresan la COX-2 cuando se cultivan con alergenos específicos a los que están sensibilizados, sin modificar la expresión de la COX-1, estando el proceso mediado por la IgE y ocurriendo a través del receptor Fcepsilon RII. La inducción de la COX-2 se manifiesta a nivel de ARNm, proteína y actividad enzimática, está mediada por las rutas de transmisión de señales que implican a las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) y al factor de transcripción NF-kappa B y es modulada por los glucocorticoiedes. Además la inhibición enzimática del enzima altera la expresión de citoquinas inflamatorias por los linfocitos. Por otra parte demostramos que el cultivo de neutrófilos de sujetos alérgicos con los alergenos responsables del cuadro clínico induce la producción de IL-8 al medio de cultivo, que fue paralela a la expresión de su ARNm. El proceso fue dependiente de IGE, y ocurrió mayoritariamente a través del receptor Fcepsilon RI, por medio de rutas de señalización que implican al calcio, las especies reactivas de oxígeno y a la fosfatasa calcineurina. Esta es la primera evidencia de la activación de ambas proteínas (COX-2 e IL-8) en células inmunes (linfocitos y neutrófilos) que participan activamente en el desarrollo de las reacciones alérgicas. Nuestros datos abren nuevas perspectivas para conocer el papel funcional de ambos tipos celulares en las enfermedades asociadas a la IgE.

Autor: VEGA RIOJA ANTONIO.
Año: 2004.
Universidad: SEVILLA [www.us.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El trabajo de investigación presentado se puede resumir en los siguientes puntos: * En este trabajo de investigación se analiza el papel regulador del agua oxigenada endógena sobre la expresión del gen de la óxido nítrico inducible (NOS2) inducida por LPS/IFN-gamma en macrófagos peritoneales de rata. Inicialmente se encontró que el agua oxigenada añadida exógenamente inhibía la expresión de la NOS2, lo cual nos llevo a analizar los efectos de la actividad de las monoamina oxidasa-A/B (MAO-A/B) y la amina oxidasa sensible a semicarbazida (SSA), como enzimas formadas de agua oxigenada sobre la expresión de la NOS2. En presencia de sus sustratos, tiramina para la MAO-A/B y benzilamina para la SSAO, tiene lugar la síntesis intracelular de agua oxigenada y la inhibición de la expresión de la NOS2, como detectamos por Western-blotting, citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. La pargilina y semicarbazida, inhibidores específicos de la MAO-A/B y de la SSAO, respectivamente, cancelan estos efectos negativos sobre la expresión de la NOS2. En presencia de cationes Fe2+ y Cu2+ se potencia la inhibición de la expresión de la NOS2, sugiriendo que especies reactivas de oxígeno derivadas de la reacción de Fenton participan en este proceso. Además se encontró que el efecto del agua oxigenada generado por monoaminas oxidasas se produce a nivel de ARNm. Estos resultados ofrecen un nuevo punto de control en la expresión de la NOS2 a través de agua oxigenada u otras especies reactivas de oxígeno. Una posible hipótesis podría ser que la inhibición de expresión de la NOS2 por agua oxigenada constituye un mecanismo de protección celular contra los efectos citotóxicos producidos como consecuencia de la activación de enzimas generadores de especies reactivas de oxigeno, encontrando, por lo tanto, un papel nuevo y singular para la familia de proteínas de las monoaminas oxidasas. * La ciclooxigenasa (COX) es una enzima clave en la síntesis de prostaglandinas. La regulación de la expresión de su isoforma COX-2 es responsable del incremento de prostaglandinas que tiene lugar durante condiciones inflamatorias, y también está involucrada en las enfermedades alérgicas. En el trabajo presente demostramos que la expresión de la COX-2 se induce fuertemente en nuetrófilos de pacientes alérgicos cuando estos son expuestos a anticuerpos anti-IgE o a alergenos a los cuales el paciente está sensibilizado. Esta inducción fue detectada tanto a nivel de ARNm como de proteína y fue acompañada por la liberación de prostaglandina E2. También mostramos evidencias de que inhibidores específicos de la NADPH oxidasa, como son el HMAP y AEBSF, inhiben completamente la expresión de la COX-2 dependiente IgE, sugiriendo que este proceso está mediado por especies reactivas de oxígeno derivadas de la actividad de la NADPH oxidasa. Además las MAP quinasas (MAPKs), p38 y ERK y el factor de transcripción NF-kappaB también están implicados en la regulación de la expresión de la COX-2, puesto que inhibidores específicos de esas dos quinasas, como son el SB03580 y el PD098059, y de la ruta de NF-kappaB, como el MG132, inhiben la expresión de la COX-2 dependiente de IgE. También se presentan evidencias de que el radical .OH generado a través de reacciones de Fenton a partir del agua oxigenada, puede constituir un posible candidato capaz de regular la expresión de la COX-2 dependiente de IgE a través de MAPKs y NF- KappaB. Los resultados expuestos muestran un nuevo papel para las especies reactivas de oxígeno como segundos mensajeros en la regulación de la expresión de la COX-2 en neutrófilos humanos durante las reacciones alérgicas. * "Nuclear factores of activated T cells" (NFATs) constituye una familia de factores de transcripción que juegan un papel fundamental en la transcripción de genes de citoquinas claves en una amplia variedad de células. La presencia de isoformas de NFAT ha 8 sido de 5f7 scrita prácticamente en todos los tipos celulares del sistema inmune, con la excepción de neutrófilos. En el trabajo presentado, hemos descrito por primera vez, la expresión en neutrófilos humanos de los ARN mensajeros que codifican las isoformas que codifican las isoformas NFAT1, NFAT2, NFAt4 y NFTA5, pero no dela isoforma NFAT3. Sin embargo, solo la proteína NFAT2 fue expresada por estas células. También hemos descrito que alergenos a los cuales un paciente se encuentra sensibilizado, son capaces de promover la translocación de NFAT2 al núcleo, en neutrófilos de dichos pacientes, un efecto que fue mimetizado por el tratamiento de los neutrófilos con anticuerpos anti-IgE. Estos anticuerpos también incrementaron la actividad de la calcineurina y la actividad de unión al ADN de NFAT2. Por último encontramos que la calcineurina fue capaz de interacciona físicamente con NFAT2. Nuestros resultados proporcionan evidencias claras de que FAT2 se encuentra constitutivamente expresado en neutrófilos humanos y se activa bajo la acción de alergenos y anticuerpos anti-IgE, en un mecanismo dependiente de la calcineurina.

Autor: CAPARRÓS CAYUELA ESTHER.
Año: 2005.
Universidad: MURCIA [www.um.es].
Centro de lectura: UNIVERSIDAD DE MURCIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ.

Resumen: En la presente tesis se ha estudiado el mecanismo de regulación de poblaciones T CD4+ y T CD8+ por distintos receptores, tanto en linfocitos T citotóxicos como en células dendríticas humanas. Por un lado, el estudio de la coagregación en membrana del heterodímero activador CD94/NKG2H y la molécula MHC-I en linfocitos T citotóxicos indicó que se produce un bloqueo de distintas vías de activación, así como de la movilización del centro organizador de microtúbulos a la zona de contacto entre la célula T efectora y la potencial célula diana. Biológicamente, el reconocimiento de receptores implicados en inhibición de la actividad citotóxica en linfocitos T CD8+ por ligandos presentes en células presentadoras de antígeno permitiría un bloqueo de la lisis de estas células por parte de células citotóxicas. Por otra parte, estudiamos los mecanismos de transmisión de señales que se derivan de laligación en membrana de la molécula CD70,. La agregación de esta proteína transmembrana tipo II induce activación de Erk MAPK, así como de Akt y del factor de transcripción NFkB, además de activar citotoxicidad en linfocitos T CD8 y CD4+. El análisis de los mutantes de la proteína generados en el laboratorio reveló la importancia de la Cys 17 y las Ser 6 y 9 de la molécula en la inducción del factor de transcripción NF-kB y supervivencia. Finalmente, analizamos las consecuencias de la agregación en membrana de la molécula DC-SIGN en células dendríticas derivadas de monocitos. DC-SIGN es una lectina tipo C propia de células dendríticas inmaduras. Está relacionada con la interacción con distintos patógenos que inducen infecciones crónicas, como citomegalovirus, Aspergillus fumigatus, HIV o el virus del ébola. La activación de DC-SIGN por sus ligandos induce una activación de Erk MAPK y Akt y movilización de calcio intracelula L incluso, esta molécula se localiza en balsas lipídicas e interacciona con otras proteínas implicadas en transmisión de señales. Además, DC-SIGN modula las señales derivadas de receptores como TLRs, favoreciendo la diferenciación de una población Th2 efectora o reguladora, que contribuye al bloqueo de la respuesta Th1, respuesta inflamatoria, y que conduciría a la eliminación del patógeno. De este modo, los patógenos que utilizan como diana DC-SIGN para su entrada a células dendríticas, no sólo lo emplean para entrar en la célula, sino que también inducen un cambio en la polarización a la respuesta inmune.

Autor: HERRANZ FALCON PATRICIA.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Las quimioquinas son una familia de proteínas de bajo peso molecular que regulan el reclutamiento de leucocitos al sitio de inflamación y regulan el tráfico celular a través del cuerpo, mediante unión a receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que se expresan en la membrana de estas células. Se ha descrito que cuando una quimioquinas se une a su receptor y tras la estabilización de la conformación dimérica del receptor, se produce la asociación de las proteínas quinasas Janus (JAK) al receptor. Estas quinasas se van a activar por transfosforilación y fosforilan al receptor en residuos de tirosina, tras lo cual se da la asociación de proteínas G al receptor. Tras la activación de estas proteínas se van activar una serie de cascadas de señalización, y es el resultado de la activación de todas esas moléculas lo que va a dar lugar a la respuesta celular final. Mediante análisis bioinformáticos pudimos predecir que los residuos Ile52, en el dominio transmembrana 1 (TM1), y Val150, en el TM4, del receptor CCR5 humano jugaban un papel clave en la estabilización de la conformación dimérica del receptor. La mutación de estos residuos generó receptores no funcionales que no dimerizaban y que además no eran capaces de señalizar. Ensayos in vitro e in vivo en líneas celulares humanas y en células T primarias mostraron que péptidos sintéticos que contenían esos residuos eran capaces de bloquear la respuesta inducida por el ligando de CCR5, CCL5. Mediante técnicas de transferencia de energía entre fluorocromos (FRET) demostramos la existencia de dímeros preformados en la membrana celular, por lo que el papel de la quimioquina parece ser el de estabilizar la conformación activa del receptor. Esta es la primera descripción de los residuos involucrados en la dimerización de los receptores de quimioquinas, y constituyen potenciales dianas para la modificación de las respuestas de las quimioquinas. Además usando el receptor CCR2 humano como modelo, hemos identificado los dominios del receptor por los que la quinasa JAK2 interacciona. Hemos visto que los residuos Leu140 y Ala141 en el segundo bucle intracelular del receptor son esenciales para la asociación de JAK. Al mutar esos residuos obutvimos receptores mutantes de CCR2 que se expresaban con normalidad en la membrana celular y eran capaces de unir ligando pero que no eran capaces de unir JAK2. Estos mutantes no eran capaces de señalizar, lo que indica que la asociación de JAK a los receptores de quimioquinas es un paso clave para la funcionalidad de las quimioquinas. A través de análisis bioinformáticos, técnicas de transferencia de enrgía entre fluorocromos, ensayos in vitro e in vivo, hemos identificado residuos que pueden constituir potenciales dianas para el diseño de fármacos que afecten a la funcionalidad de las quimioquinas de forma específica.

Autor: Gómez Lozano Natalia.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: Biología Molecular. Facultad de CIencias. UAM.
Centro de realización: Biología Molecular. Facultad de CIencias. UAM.

Resumen: Los receptores KIR (Killer-cell Immunoglobulin-like Receptors), tras el reconocimiento de sus ligandos, las moléculas de MHC clase I, regulan la respuesta de las células NK dirigida frente a células diana potenciales. Los genes KIR se localizan en la región cromosómica 19q13.4, en un complejo compuesto por hasta 15 genes y 2 pseudogenes, todos ellos con un alto grado de polimorfismo y formas alternativas de procesamiento. KIR2DL5 es el miembro de la familia descrito más recientemente, cuyo gen está presente sólo en algunos individuos. Nuestro grupo ha estudiado su variabilidad intrínseca y su implicación en la diversidad haplotípica de los genes KIR. Este estudio ha identificado a KIR2DL5 como un "punto caliente" de la diversidad KIR, en el cuál se han producido diferentes recombinaciones. Hemos demostrado la existencia de dos loci que codifican para KIR2DL5 (KIR2DL5A y KIR2DL5B), que pueden aparecer por separado o conjuntamente en el mismo haplotipo. También hemos descubierto tres nuevos alelos de KIR2DL5 (KIR2DL5A*005, KIR2DL5B*006 y *007) y un sobrecruzamiento desigual entre KIR2DL5 y KIR3DP1, que es presumiblemente el origen de dos haplotipos inusuales: aquellos portadores de una duplicación de los genes conservados KIR3DP1-KIR2DL4-KIR3DL/S1 o una deleción de los mismos genes. Estos haplotipos nos han permitido descartar una función esencial para KIR2DL4, un receptor para HLA-G, en reproducción, e identificar un alelo quimérico funcional del pseudogén KIR3DP1 que podría codificar para un receptor soluble. La expresión de KIR2DL5 es variable: tiene alelos transcritos en linfocitos NK y T y otros que se comportan como pseudogenes no transcritos. Esta divergencia se correlaciona con polimorfismos de las regiones promotoras. Hemos analizado la unión de factores de transcripción RUNX al promotor de los alelos de KIR2DL5, la actividad de estas regiones in vitro, y el efecto de una droga desmetilate en la expresión de KIR2DL5. Estos ensayos demuestran que los alelos no expresados de KIR2DL5 tienen promotores potencialmente funcionales, pero que están silenciados in vivo por mecanismos epigenéticos, en los cuales los factores RUNX podrían estar implicados.

Autor: Aceves Tejero Mónica.
Año: 2007.
Universidad: VALLADOLID [www.uva.es].
Centro de lectura: Facultad de Medicina.
Centro de realización: Universidad de Valladolid - Facultad de Medicina.

Resumen: El factor de transcripción NFAT es expresado durante la respuesta inmune e inflamatoria. Es blanco farmacológico de los inmunosupresores ciclosporina A y FK506 que revolucionaron el campo del transplante de órganos en la década de los 80. Estos fármacos inhiben la fosfatasa calcineurina que a su vez inhibe la desfosforilación de la proteína y el transporte de ésta al núcleo. Además, la activación de la función de NFAT se ve afectada por el uso de fármacos antiinflamatorios como salicilatos y derivados trifluorometilados. Hemos observado que salicilatos inhiben la activación del factor de transcripción e inhibe el transporte de la proteína al núcleo, sin embargo, salicilatos y derivados trifluorometilados inhiben la unión de NFAT al ADN, y por lo tanto la inhibición de la expresión de los genes que regula. Puesto que ámbos fármacos inhiben la cascada de activación de NFAT a dos niveles diferentes, estudiamos la combinación de ámbos para tratar de reducir los efectos indeseados del uso de CsA a elevadas dosis y alta concentración. Conseguimos reducir la dosis de uso actual de CsA combinándola junto con una dosis de triflusal utilizada en terapética, de tal manera que se inhibía la actividad mediada por NFATal igual que cuando se utilizaban dosis consideradas en la actualidad como óptimas. Queda por resolver si estos efectos podrían ser utilizados en clínica como alternativa a la terapia inmunosupresora actual.