BIOQUIMICA MOLECULAR

Autor: SANTIAGO JOSEFAT MARIA BELEN.
Año: 2002.
Universidad: EXTREMADURA [www.unex.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Gran parte de los estudios realizados sobre el receptor de dioxina (AhR) en los últimos años se ha centrado en definir su contribución a procesos fisiológicos y al mantenimiento de la homeostasis celular. La así denominada función endógena del AhR implicar, per se, la existencia de mecanismos moleculares de activación transcripcional independientes de la interacción con ligandos exógenos. En el trabajo presentado en esta Tesis Doctoral hemos aportado un posible mecanismos de regulación de la actividad del AhR en ausencia de ligandos exógenos. Estos estudios se han centrado en la regulación llevada a cabo por la maquinaria celular de proteolisis mediada por el proteosoma. Así, hemos observado que exite relación entre la inhibición de esta maquinaria proteolítica y el nivel de activación del AhR mediante un mecanismo en el cual podría participar un aumento en los niveles de ARNT a através de la fosforilación de Sp1 por PKC. Por otra parte, hemos abordado el análisis de genes expresados diferencialmente entre cutlivos primarios de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) silvestres y "knock-out" para el AhR (Ahr-/-). En este sentido, hemos centrado nuestro estudio en el gen que codifica para una proteína de unión de la forma latente del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-Beta1), denominada LTBP-1. Este gen se sobreexpresa en los ratones Ahr-/- con respecto a ratones silvestres. Por otra parte, los niveles de TGF-beta, tanto de la forma activa como de la forma latente, detectados en MEFs procedentes de ratones Ahr-/- son significativamente mayores que los encontrados en MEF2 de ratones silvestres. Además, en el medio de cultivo de MEFs Ahr-/- hemos detectado una menor activación de la MMP-2, tanto de forma pro-MMP-2 como de las formas activas.

Autor: POSADAS MAÑANES SINFORIANO JOSE.
Año: 2003.
Universidad: MÁLAGA [www.uma.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Este trabajo explora mediadores esenciales en la respuesta inmunológica como son las citocinas en la monitorización de las reacciones de alérgicas a medicamentos. Se trata de un estudio descriptivo donde se analiza la expresión del gen y la proteína de un grupo de estos mediadores inmunológicos mediante distintas técnicas de bioquímicas y de biología molecular como son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR competitiva, PCR en tiempo real y enzimo-inmunoensayo. Los grupos de individuos (pacientes y controles) incluidos en el trabajo fueron validados en la diagnosis de las distintas entendidas clínicas agrupadas como reacciones inmediatas a medicamentos y reacciones no-inmediatas a los mismos. Los controles fueron individuos sanos; y expuestos a los mismos medicamentos que provocaron las reacciones alérgicas en los pacientes. Se pudieron establecer distintas asociaciones entre citocinas, entre las determinaciones realizadas por diferentes técnicas. La conclusión principal de la tesis es que las reacciones alérgicas a medicamentos siguen el paradigma Th1/Th2 correspondiendo el primer perfil de citocinas a las reacciones no-inmediatas y el segundo a las reacciones inmediatas a medicamentos. También se pudo confirmar dicha conclusión cuando se analizaron los factores de transcripción que intervienen en el control de la síntesis de las citocinas analizadas. Por último también se pudo demostrar que los mediadores que intervienen en la apoptosis celular como la perforina, granzima B yFas-L participan en los mecanismos efectores de las células del sistema inmunológico en las reacciones no-inmediatas.

Autor: TITOS RODRÍGUEZ ESTHER.
Año: 2003.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA,UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: La fibrosis hepática es el resultado de un proceso inflamatorio y de reparación de tejido en respuesta a un daño hepático prolongado y se define como la acumulación de tejido conectivo en el hígado debido a un importante desequilibrio entre la produción y la degradación de matriz extracelular.Mientras que la fibrosis hepática es un proceso reversible, su estado final, la cirrosis está considerado como el estdio irreversible y final de la emfermedad.Cuando la cirrosis es ya severa se produce la completa desestrcturación del parénquima hepatico dando lugar a la aparición de insuficiencia hepática y trastornos hemodinámicos graves.Una de la primeras complicaciones hemodinámicas es la aparión de hipertención portal que tiene lugar como consecuencia de un incremento de la resitencia intrahepática al paso de flujo sanguíneo portal así como de un aumento intríseco del tono vascular de la microvasculatura hepática. Existe un enorme interés cientifico no sólo por esclarecer los mecanismos celulares implicados en el desarrollo de fibrosis y cirrosis hepática sino también por identificar nuevas estrategias terapéuticas enfocadas a revertir o prevenir la prograsión de esta enfermedad hepática. Una de las posibles dianas terapéuticas la constituye la vía biosintética de la 5-LO. La 5-LO es la enzima clave responsable de la síntesis de LTS, importantes mediadores lipídos derivados del AA.Este grupo de eicosanoides incluye al LTB4 implicado principalmente en la respuesta inflamatoria y los cisteinil-LTS(LTC4/LTD4/LTE4)que son potentes agentes vasosontrictores capaces de incrementar la permeabilidad vascular y ejercer hepática de perfusión como la extravasación de fluido vascular.Además , los estudios clínicos demuestran que en los pacientes con hapatopatía existe un incremento en la producción de estos eicosanoides lo que se ha asociado con el desarrollo de un incremento en la resistencia intrahepática existe un incremento en la producción de estos eicosanoides lo que se ha asociado con el desarrollo de un incremento en la resistencia intrahepática y la aparición de colestasis.Sin enbargo y hasta la relación de este proyecto de tesis doctoral, no se conocían con exactitud los mecanismos celulares de síntesis de estos eicosanoides en el hígado así como la implicación fisiopatológica de estos compuestos en el desarrollo de la cirrosis hepáticas y sus complicaciones. Por ello, los objetos generales de este trabajo fueron: 1. Caracterizar la biosíntesis y papel funcional de los cistenil-LTS en el sinusoide hepático. 2. Investigar el papel de la célula de Kupffer y de la 5-LO en la patogénesis de la fibrosis hepática experimental. En resumen, los resultados de este trabajo indicaron que en el hígado no sólo la célula de Kupffer contribuye a la producción endógena de cisteinil-LTS sino que los hepatocitos contribuyen de forma importante a su producción mediante metabolismo transcelular .Además estos icosanoides pueden ejercer acciones paracrinas sobre las células hepáticas estralladas y contribuir así al aumento de la resistencias intrahepáticas y a la aparición de hipertensión portal.Además , los resultados proporcionan la primera evidencia de que la presencia activa de la vía metabólica de la 5-LO es crítica para la supervivencia de las células de Kupffer y demuestran que la inhibición de la vía de la 5-LO en las células de Kupffer puede reducir la progresión de la fibrosis durante el daño hepático crónico experimental.

Autor: DUFLOT SYLVIE.
Año: 2003.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UB.

Resumen: Las funciones del hígado son importaciones debido a su localización estratégica, entre el sistema digestivos y el resto del cuerpo (la circulación sistémica).La generación de los anticuerpos contra los transportadores de nucleósidos sodio-dependientes Rcnt1 (pirimidina preferente)y rCNT2 (purina preferente) permitieron identificar la presencia de estos dos trasportadores en hígado.El primer objetivo de esta tesis es establecer la localización y la ditribución subcelular de Rcnt1-y Rcnt2 en hepatocitos de rata. Los hepatocitos representan un 60-80% de la masa celular totaldel hígado:son células altamente polarizadas y se caracterizan po tener una membrana plasmática diferenciada en tres dominios funcionales diferentes:la membrana basal la apical y la lateral.Por estas características y po ser muy activos metabolitamente,las células hepáticas son un buen modelo para el estudio de las rutas endocíticas.Examinamos la localización sbcelular de tres maneras distintas.Primero , detectmos por técnica de transporte y por Western blot la expresión de CNT1 y CNT2 en fraciones purificadas de endosomas de hígado de rata ,mediante utilización de anticuerpos contra los transtornos . Tercio por técnicas de microscopía electrónica .Estos estudios indican que el transportador de nucleosidos CNT1 llega en la membrana canalicular, en la cual el transportador es biológicamente activo, por una ruta indirecta a través de la membrana basolateral. Su inserción se realiza cerca de microdominios especilizados enriquecidos en caveolas. CNT2 se detecta de manera casi exclusiva en preparaciones enriquecidas en membranas plasmáricas basolaterales en las cuales el transportador es activo.Estos estudios nos indican que los dos transportes CNT1 y CNT2 tienen una ubicación diferente en células hepáticas, por lo que estos dos transportadores parecen estar diferenicalmente regulados.En la segunda parte de esta tesis examinamos las interacciones entre el transportador concentrativo de adenosina CNT2 y los receptores purinérgicos.Las células hepáticas previamente tratadas, a corto plazo, con el el agonista del receptor A-1, (-)-N(6)-(2-phenylisopropy)adenosine(RPIA) produce el incremento de la actividad de trasporte de CNT2.Este efecto se inhibe en presencia de inhibidores de los canales KATP y mimetiza en presencia de activadores de dichos canales.Estos estudios revelan que en células hepáticas, la actividad de transporte de CNT2 se regula por activación de receptores A-1, vía los canles KATP.Se ha demostrado también que la inducción de la actividad de transporte de CNT2 mediante la apertura delos canales KATP es dependiente a la activación de la PKC.Por último,observamos que la glicemia y el matabolismo de la glucosa podrían afectar la regulación purinérgica de CNT2 ya que la inducción de la actividad de CNT2 mediante el receptor A-1 puede ser modulada con la concentración en glucosa del medio.Estudiamos en la tercera parte de esta tesis el papel del óxido nítrico y de la PKC en la activación post-traduccional de CNT2 en células hepáticas.Medimos la actividad de transporte de CNT2 en células Fao y en cultivo primario de hapatocitos después de incubar las células con diferentes activadores e inhibidores de la óxido nítrico sintasa (NOS).El resultado fue que la inhibición de la NOS provoca un aumento de la actividad se transporte de CNT2 de un 60%.Mediante inhibidores de la actividad de la PKC y bloqueadores de los canales KATP, determinamos quela disminución de la concentración intracelular de óxido nítrico contribuye en la activación, a corto plazo,del transportador CNT2 mediante la activación, independientemente de la PKC, de los canales katp.

Autor: FIGUEROA MORALES SALVADOR.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID [www.ucm.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOQUҍMICA-FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El NO es una molécula gaseosa con numerosas implicaciones fisiológicas y patológicas. En el presente trabajo se han estudiado ambas vertientes de la molécula sobre cultivos primarios de neuronas corticales de cerebro de rata, empleando como dador de NO el S-nitrosotiol S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP). En el sistema objeto de estudio, el NO manifiesta un efecto dual neurotóxico y neuroprotector, que es dependiente de la dosis y del tiempo de exposición al dador de NO. Así, dosis bajas de NO son capaces de contrarrestar la apoptosis -mediada por caspasa 3- inducida por la retirada del soporte trófico del medio de cultivo. Este efecto neuroprotector del NO frente a la privación de suero cursa con un incremento del contenido intracelular de proteínas antiapoptóticas de la familia de Bcl-2, especialmente, Bcl-XL, frente a proteínas proapoptóticas, como Bax, además de una disminución de la actividad de caspasa 3. Dosis por encima de aquellas que inducen neuroprotección producen una disminución de la viabilidad celular, mediante un proceso apoptótico en el que interviene la mitocondria: despolarización de la membrana mitocondrial interna, apertura del poro de permeabilidad transitoria mitocondrial bajo ciertas cirunstancias, liberación de citocromo c desde el espacio intermembranal al citoplasma y activación de caspasas. A las dosis más altas de NO empleadas, se observa una convivencia de procesos muerte de carácter necrótico y apoptótico. Junto a las evidencias de apoptosis, se detecta la liberación de la enzima LDH y de ATP al medio de cultivo, lo que es indicativo de lisis celular. El estrés oxidativo desempeña un papel importante en la muerte celular inducida por altas concentraciones de NO, como demuestran el incremento en el contenido intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la detección de peroxidación lipídica. Junto a los efectos mediados por NO sobre la viabilidad celular, en este trabajo se exponen datos de la acción del NO como modulador de la neurotransmisión. El NO es capaz de incrementar la liberación basal de neurotransmisores (glutamato, aspartato, glicina y GABA), así como de regular la secrección inducida por una gente despolarizante de la membrana plasmática (KCI) y agonistas de receptores glutamatérgicos.

Autor: TORRES GUZMÁN RAQUEL.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID [www.ucm.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA (UCM).

Resumen: RESUMEN Las penicilinas, G o V, se producen industrialmente mediante procesos fermentativos en los quetambién se producen, de forma colateral, otras penicilinas de cadena lateral lineal (penicilina F,dihidro F y K). La presencia de estas penicilinas dificulta la posterior obtención y purificación del 6-APA, material de partida para la obtención de penicilinas, semisintéticas. La penicilina acilasa de Streptomyces lavendulae ha sido descrita Como una penicilina V acilasa capaz de hidrolizar, además dichas penicilinas alifáticas, No se ha descrito otra penicilina acilasa con esta especificidad de sustrato. Esta es una de las razones por las que se encontró interesante el estudio de esta enzima, de cara a su posible utilización en biorreactores industriales destinados a la obtención de 6;.APA. Las penicilma acilasas han sido además incluidas dentro de una superfamilia de proteínas descrita recientemente, las Ntn-hidrolasas. En este grupo se han incluido fundamentalmente enzimas que hidrolizan penicilina G o glutaril 7-ACA, pero poco se conoce acerca de las enzimas específicas de penicilina V, esto es otro motivo por el que resulta interesante el estudio de, la enzima de Streptomyces lavefuJulae como ejemplo de penicilina V acilasa 1. Se ha optimizado un método de producción. de penicilina acilasa de Streptomyces lavendulae, utilizando leche, desnatada como medio de cultivo, en condiciones de agitación orbital a 20°C. En estas condiciones se consiguió producir cantidad suficiente de enzima para. tras Su purificación, abordar los estudios de caracterización. La producción de la enzima sufre represión por catabolito en presencia de azúcares (glucosa y lactosa). 2. Se consiguió un método de purificación sencillo, en cuatro pasos. que permitió obtener una preparación de penicilina acilasa pura a partir de los, caldos de fermentación de Streptomyces lavendulae 3. La penicilina acilasa de Streptomyces lavendulae, esta compuesta por dos subunidades de diferente tamaño, una subnidad a de 21.4 KDa y una submridad beta de 59 IDa, que forman un heterodímero alfa beta de 80 KDa. 4. La actividad de Ía penicilina acilrisa de: Stréptomyces lavendulae es potenciada en presencia de cosolvente orgánico acuoso. Esta activación depende de la naturaleza del disolvente orgánico y de su concentración en el medio de reacción. Los alcoholes y polioles. podrian participar en la catálisis actuando como nucleófi1o alternativo al agua. Los disolventes polares apróticos, alteran las, propiedades fisicoquimicas de medio afectando así a lasolubilidad del sustrato y de los productos de la reacción así como a la flexibilidad conformacional de la enzima. 5. La penicilina acilasa de Streptomyces lavendulae actúa siguiendo un mecanismo cmético ordenado Uní-Di, en el que el ácido 6-arninopenicilánico es el primer producto liberado. La reacción trascurre mediante la formación de un intermedio acil-enzirna, que sufre el ataque nucleófilo de una molécula de agua, con la consiguiente liberación de ácido fenoxiacético. 6. Un residuo de naturaleza catiónica con un pK de 6,45 ha sido identificado como esencial para la actividad. Este residuo estaría implicado tanto en la catálisis como en la unión del sustrato. Teniendo en cuenta los resultados de variación de Vmax_Vmax/KM y K¡ con el pH, la , los ensayos de perturbación con disolvente y los resultados de la modificación de la proteína con reactivos específicos, el residuo propuesto como responsable de la actividad catalítica de la penicilina acilasa de Streptomyces lavendulae es la serina terminal localizada en la subunidad beta (ser beta 1). 7. La penicilina acilasa de Streptomyces lavendulae hidroliza preferentemente sustratos con cadena lateral hidrofóbica y presenta una buena eficacia catalítica (KcalKu) para hidrolizar penicilinas de cadena lateral alifática. como la penicilinas F, dihidroF y K. 8. El sitio de unión..de la porción acilo del sustrato, tiene un de marcado caráct 8 er hidró 396 fóbico,y en forma de túnel, .capaz de albergar cadenas hidrocarbonadasde al menos ocho átomos de carbono. 9. La penicilina acilasade Streptomyces lavendu/ae posee residuos de serina esenciale/s para la catálisis..Además se ha identificado que el aminoácido N-temrinal de la subunidad beta es una serina. Ambos resultados nos llevan a proponer a la enzima como una Ntn-hidrolasa, es decir que la serina beta 1 sería el nucleófilo que ataca al carbono carbonílico del sustrato para formar el intermedio acil-enzima.

Autor: CUESTA DE LA PLAZA ISABEL.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID [www.ucm.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.
Centro de realización: F.CC. BIOLÍGICAS (UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID).

Resumen: El virus respiratorio sincital humano (VRSH) es un pneumovirus de la familia paramyxoviridae, que causa infecciones graves en el tracto respiratorio inferior en niñós pequeños , personas inmunodeprimidas o con afecciones cardiovasculares y ancianos. Hechos tales como la variabilidad antigénica del virus, que afecte a poblaciones tan diferentes y la incapacidad de la primoinfección para desarrollar una respuesta inmune protectora y duradera , sugieren que las estrategias más adecuadas a seguir para le control sanitario de la infección es desarrollar compuestos antivirales y generar mediante genética reversa virus vivos atenuados vacunales. Las ribonucleoproteínas son componentes internos de las pratículas virales y las unidads funcionales para los procesos de transcripción y replicación viral. Están compuestas por el RNA viral, de polaridad negativa no segmentado, fuertemente unido a la proteína N constituyendo la nucleocápsida viral, a esta se le une la RNA polimerasa viral, proteína L, y sus cofactores las fosfoproteínas P y M2-1 . Las proteínas de las RNPa son multifuincionales y están implicadas en funciones específicas virales, lo que las convierte en dianas idóneas para la acción de compuestos antivirales y portadores de mutaciones que confeirían atenuación a virus vivos. Con el fin de entender como desempeñan dichas proteínas sus funciones durante el ciclo de crecimiento del virus a nivel molecular, etudiamos algunas de las interaciones que establecen con diferentes componentes virales. Demostramos que la proteína M2-1 une RNA, con una cinética cooperativa y reconoce la secuencia del Crna leader en el contexto de un RNA de 86nt. La región de unión a RNA se localizó entre los residuos 33-37,43-48 y 59-62 de la proteína . Se determinó que la T59 y S58 sonlos residuos que se fosforilan y que dicha modificación disminuye su unión a RNA. La interación de la proteína M2-1 con el RNA a través de los residuos 33-37 y 43-48 es esencial para la actividad antiterminadora y/o elongadora que la proteína desempeña durante la transcripción viral. Se purificó proteína N libre de RNA y se demostró que tiene capacidad de unir cualquier RNA, sin especificidad de secuencia. Se han localizado los residuos de la proteína N que contactan con el RNA, son alguno o todos los situados en posiciones I242,F243,W246,F247,258-271,E355,Q356 y E359, localizados todos ellos dentro del cuerpo globular dela proteína. La cola C-terminal (residuos 365-391)protege una región de interacción el el RNA localizada en el extremo N-terminal (residuos 87-92). También hemos determinado los residuos a través de los cuales interaciciona con la proteína P (A244,G245, M248MQ356,E359 y G361) y encontramos que son los mismos o están muy próximos a los que interaccinan con el RNA , indicando que ambas interacciones pueden ser excluyentes. Estos resultados permiten delimitar regiones de ambas proteínas del VRSH (N y M2-1) dianas para interacción con compuestos antivirales específicos para el VRSH.

Autor: AGUILAR IZQUIERDO SUSANA.
Año: 2003.
Universidad: POMPEU FABRA [www.upf.edu].
Centro de lectura: DEPARTAMENTO DE CIENCIAS EXPERIMENTALES Y DE LA SALUD.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE CIENCIAS EXPERIMENTALES Y DE LA SALUD.

Resumen: El cáncer de páncreas es la quinta causa de muerte en el mundo occidental y uno de los tumores más agresivos. El sistema del plasminógeno es importante en la trombólisis intravascular y en procesos biológicos que requieren la migración celular como la angiogénesis y la progresión tumoral. La activación del plasminógeno, mediada por el activador tisular del plasminógeno (tPA) y el activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA), resulta en la degradación de proteínas de la matriz extracelular y la activación de MMPs y factores de crecimiento latentes. El objetivo de esta tesis ha sido estudiar el papel del tPA en la progresión tumoral in vivo mediante el uso de modelos murinos de cáncer de páncreas y analizar su mecanismo de acción. Como modelo de tumorigénesis pancreática se utilizaron los animale stransgéncios Ela1-Tag y Ela1-myc. Asimismo se utilizaron los animales transgénicos Ela1-CCK2 y MT-TGF-a, como modelo de metaplasia acinar-ductal. Los resultados muestran que tPA no se detecta en ningún tipo celular epitelial en el páncreas normal ni en ductos metaplásicos ni en células acinares tumorales, encontrándose sobreexpresado en los duxtos neoplásicos pancreáticos. Por otro lado, anexina A2 se detecta en el dominio apical del epitelio de ductos normales y complejos ductales y se encuentra sobreexpresada y despolarizada en los ductos neoplásicos. Con el fin de determinar el efecto de la inactivación del tPA al desarrollo de los tumores de los ratones Ela1-myc se cruzaron estos animales transgénicos con ratones knock out para tPA (tPA-/-). Los ratones híbridos Ela1-myc;tPA-/- también desarrollan tumores pancreáticos y la proporción de tumores con componente ductal no se modifica. Sin embargo, se observó un incremento de la supervivencia en los animales que no expresan tPA, indicando que esta proteasas favorece la progresión del tumor. El análisis de factores relacionados con progresión tumoral indicaron que los tumores de los ratones Ela1-myc:tPA-/- muestran menor vascularización y tasa de proliferación, mientras que la invasión no se ve afectada. Para estudiar los efectos de la expresión directa de tPA en el páncreas, en células acinares o ductales, se generaron ratones transgénicos que sobreexpresan tPA bajo el control del promotor de elastasa1 (Ela1-tPA) o citoqueratina 19 (CK19-tPA) respectivamente. Los resultados del análisis alteraciones en el páncreas. No obstante es necesario un estudio más exhaustivo del fenotipo.

Autor: PEY RODRIGUEZ ANGEL LUIS.
Año: 2003.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS,AUTONOMA DE MADRID.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UNIVERSIDAD ATONOMA DE MADRID.

Resumen: En este estudio se han realizado análisis de expresión de mutaciones causantes de fenilcetonuria (PKU) con el fin de caracterizar sus efectos sobre el plegamiento, la estabilidad y la función de la proteína PAH. Los resultados obtenidos han permitido profundizar en la correlación genotipo-fenotipo y en los mecanismos responsables de la respuesta al tratamiento con el cofactor (BH4) en PKU. Las mutaciones PKU han sido expresadas en E.coli como proteínas de fusión MBP-PAH, determinándose los niveles de proteína y actividad PAH en extractos solubles, y el estado de oligomerización y la estabilidad térmica de las proteínas usando MBP-PAH purificadas. También se ha determinado la velocidad de degradación de las proteínas PAH expresadas en un sistema libre de células, mediante experimentos de pulso-caza. Las mutaciones analizadas pueden clasificarse en dos grupos: 1) mutaciones estructurales, que afectan al plegamiento y estabilidad de la proteína, y se caracterizan por presentar un descenso en los niveles de proteína PAH solubles, de formas oligoméricas funcionales (tetrámeros y dímeros) y una menor estabilidad térmica. Para estas mutaciones también se ha observado una velocidad de degradación proteolítica acelerada, según experimentos de pulso-caza. La coexpresión de chaperoninas bacterianas GroEL y GroES (condiciones permisivas) incrementa la actividad PAH residual para la mayoria de estas mutaciones, confirmando el efecto sobre el plegamiento de la PAH. La actividad PAH residual para la mayor parte de estas mutaciones se correlaciona adecuadamente con el fenotipo metabólico en pacientes, y cuando se observan inconsistencias en la correlación genotipo-fenotipo en pacientes para algunas de ellas, la potencial modulación observada en condiciones permisivas permite sugerir que diferencias individuales en el control de calidad proteico celular (chaperonas y sistemas proteolíticos) podrían explicar estas inconsistencias observadas en pacientes. 2) mutaciones catalíticas, que anulan la función enzimática probablemente afectando a residuos esenciales para la catálisis en el centro activo de la enzima y que presentan un elevado rendimiento en formas oligoméricas funcionales que carecen de actividad. Para estas mutaciones, la modulación en condiciones permisivas no modifica la actividad PAH residual, y estas mutaciones están claramente asociadas a fenotipos graves. Catorce mutaciones PKU asociadas a la respuesta en pacientes han sido expresadas in vitro en E.coli y en un sistema libre de células. Se ha aplicado una combinación de análisis cinéticos (estado estacionario), calorimetría de titulación isoterma (unión en condiciones de equilibrio), espectroscopía de CD (efecto de la BH4 sobre la estabilidad térmica) y expresión en un sistema eucariota libre de células (efecto sobre la actividad) con el fin de evaluar posibles defectos en la afinidad por BH4 y caracterizar el efecto del cofactor sobre la actividad y la estabilidad de la PAH. Cinco mutaciones presentaron una afinidad disminuida por el cofactor en condiciones de estado estacionario, mientras que tres de ellas mostraron también defectos en condiciones de equilibrio, contribuyendo estos efectos a la respuesta a BH4 en pacientes. Todas las mutaciones estudiadas presentan alteraciones en las propiedades catalíticas y reguladoras, afectando a la cooperatividad y activación por L-Phe, y reduciendo en algunos casos la afinidad aparente por el sustrato. Estos resultados sugieren que el comportamiento cinético anormal observado podría también contribuir a la patogénesis de la PKU. Además, se ha observado una posible rel 8 ación en 52f tre el estado de activación, la afinidad por BH4 disminuida y una diferente sensibilidad a la estabilización térmica por el cofactor para algunas de las mutaciones estudiadas. La expresión en el sistema libre de células ha revelado un incremento moderado de la actividad PAH cuando las proteínas se sintetizan en presencia de BH4, además de protegerlas frente a la inactivación oxidativa una vez sintetizadas. En conclusión, nuestras aproximaciones experimentales sugieren que la respuesta a BH4 es un proceso multifactorial, en el que existen contribuciones de los defectos en la afinidad por BH4 y el efecto protector del cofactor frente a la inactivación oxidativa.

Autor: CAPILLA RUBIO SILVIA.
Año: 2003.
Universidad: ZARAGOZA [www.unizar.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Y. enterocoLiticcr 0:3 es una bacteria capaz de causar gastroenteritis que se transmite a través de agua o alimentos contaminados y en algunos casos puede ser necesario el tratamiento antibiótico. El objetivo de este estudio es analizar los mecanismos de resistencia a quinolonas y otros antibióticos en una selección de cepas clínicas de Y. enterocolítica 0:3 resistentes al ácido nalidíxico. Para ello hemos estudiado la presencia de mutaciones en la diana de las quinolonas y posibles alteraciones en la permeabilidad como mecanismos de resistencia. Los resultados muestran que una mutación en GyrA es la responsable de la resistencia a quinolonas aunque la presencia de bombas de expulsión puede modular la concentración inhibitoria mínima(CIM) a este antimicrobiano. Hemos realizado el análisis de la resistencia a aminoglicósidos y los resultados han demostrado la - presencia de una enzima modificante de aminogIicósidos ( ANT (3") (9)) como principal implicada. Paralelamente, en el estudio de la resistencia a cloranfenicol hemos encontrado la presencia de la enzima , cloranfenicol acetil transferasa como responsable de la resistencia aunque la presencia de bombas de expulsión también puede modular la CIM. Hemos estudiado la presencia de plásmidos e integrones como mecanismos de transmisión horizontal y los resultados obtenidos muestran que los plásmidos contienen genes implicados en la virulencia y en la mayoría de los integrones hemos encontrado la presencia del gen aadA que codifica para la enzima - modificante de amiglicósidos ANT (3") (9). Finalmente, los resultados del estudio epidemiológico de todas las cepas mediante la técnica de campo pulsado utilizando diferentes enzimas de restricción nos sugiere que Y. enterocolitica 0:3 es una bacteria con poca diversidad genética.

Autor: RODRIGUEZ SANTIAGO BENJAMÍN.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAT DE BIOLOGÍA , UNIV DE BCN.

Resumen: Estudio sobre la implicación de la mitocondría en pacientes con enfermedad de alzheimer de tipo esporádico.Se han analizado muestras procedentes de necropsia de tres regiones cerebrales y nuestras de sangre. Los análisis moleculares incluyeron estudios del nutDNA para detectar mutaciones puntuales, reordenamientos , cambios en la cantidad de nutDNA y cambios en la expresión génica de diversos RNAS mitocondriales.También se realizaron estudios bioquímicos para evaluan la afectación en la función de la cadena respiratoria mitocondríal , responsable de cubrir el 90% de las necesidades energéticas celulares. La comparación entre pacientes y controles no reveló diferentes significativas al estudiar el nutDNA y la función de la cadena respiratoria mitocondríal.

Autor: CARRASCAL PEREZ MONTSERRAT.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: En situaciones patológicas , como en el caso de la autoinmunidad , las células epiteliales de tejidos expresan ectopicamente meléculas de MHC de clase II.El estudio de los mecanismos que dan lugar a la formación de los complejos MHC-péptido, su presentación en la superficie de la APC y el reconocimiento de los mismos por parte de las células T es fundamental para poder entender, no sólo la respuesta inmune a infecciones, sino también patologías tan relevantes como el cáncer, la autoinmunidad o el rechazo de y/o mantenimiento de la enfermedad. En esta tesis se ha abordado el estudio de la presentación de péptidos por moléculas de MHC de clase II utilizando diversas estrategias proteómicas.En primer lugar,el trabajo se centró en la caracterización de los repertorios peptídicos asociados a una APC y a células epiteliales que expresaban moléculas de MHC de clase II, secuenciándose más de 300 ligando peptídicos,incluyendo diversos péptidos presentados ex vivo en tiroides afectados por una patología autoinmune.Mediante este estudio se mostró que existen diferencias en los repertorios asociados a las células epiteliales frente a los presentados por las APC, tanto en las caracteristicas de los péptidos como en las de las proteínas de las cuales derivan.Asimismo, se muestra como la expresión de las chaperonas HLA-DM y li afecta a las características del repertorio.Finalmente , se identificaron péptidos de clase II presentados en tiroides humanos afectados por la enfermedad de Graves-Basedow, entre ellos un péptido derivado de la tiroglobulina, una proteína descrita como autoantígeno de esta enfermedad.En una segunda parte del trabajo se ha estudiado el efecto de la trasfección de las moléculas HLA-DR,HLA-DM y li sobre el proteoma de las células epiteliales y se han identificado diversas proteínas implicadas en este proceso , mostrando que a pesar de no existir cambios drásticos en el proteoma global , algunas proteínas implicadas en el metabolismo celular varían su expresión. Asimismo, se han identificado 30 proteínas que se encuentran asociadas directamente o a través de otras moléculas con las moléculas de HLA-DR4 en la célula , entre ellas diversas chaperonas y enzimas de oxidoreducción , y proteínas implicadas en el transporte asociado a membranas.La expresión de estas proteínas dependía además de la expresión de la chaperonas li y DM por lo que se sugiere que algunas podrían estar implicadas en la generación , procesamiento o presentación de péptidos por las moléculas de MHC de clase II.

Autor: MOORE CARRASCO RODRIGO ERNESTO.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: La caquexia es un síndrome frecuentemente asociado al crecimiento tumoral, así como también a otros estados patológicos como son sepsis, SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida), diabetes, etc. La caquexia se caracteriza por una importante y progresiva pérdida de peso corporal debida principalmente a la desaparición de las reservas de grasa y a la disminución de masa muscular. Está acompañada también de anorexia, náuseas, astenia, debilidad, alteración de la homeostasis hormonal e inmunodepresión. Sobre los factores de transcripción que podrían estar involucrados en el proceso de desgaste muscular observado en la caquexia (in vivo), se sabe muy poco, pero aparecen algunos factores como posibles candidatos tanto en el desencadenamiento como en la regulación de este proceso. NF-KS y AP-1 son dos factores de transcripción que están activados en distintos tejidos en procesos inflamatorios. Se ha descrito que NFKSy AP-1 tienen una regulación diferencial en músculo esquelético de rata durante el proceso de sepsis. El mismo grupo ha determinado que C/ESP, otro factor de transcripción involucrado en el proceso de inflamación, aumenta su actividad de unión al DNA en músculo de ratas sépticas, y que este proceso es dependiente de glucocorticoides. Los objetivos de este estudio son: 1) analizar la regulación de algunos factores de ranscripción en el músculo esquelético durante la caquexia inducida por el crecimiento tumoral. 2) revertir el desgaste muscular asociado al crecimiento tumoral mediante estrategias basadas en factores de transcripción desde un punto de vista farmacológico. 3) aproximaciones a una terapia contra la caquexia mediante un adenovirus para la transferencia génica de un dominante negativo de AP-1. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que el factor de transcripción AP-1 presenta una regulación diferencial en el músculo esquelético durante el crecimiento tumoral, lo que sugiere que este factor está implicado en el desarrollo de la caquexia asociada al cáncer. Por el contrario, otros factores de transcripción estudiados (NFKS,C/ESP Y Sp-1) no parecen estar implicados directamente en el desarrollo del proceso caquéctico, al menos a nivel muscular. El factor miogénico MyoD presenta importantes cambios en sus niveles en el músculo esquelético de diferentes modelos experimentales de tumores caquécticos, así como en el músculo de pacientes con cáncer de páncreas. La administración aguda de LPS a ratas también afecta marcadamente los niveles musculares de MyoD. Estos datos sugieren una implicación de dicho factor en el desarrollo de la caquexia asociada al crecimiento tumoral y otros procesos patológicos. La administración de SP100030, inhibidor de NF-KSy AP-1, logra revertir parcialmente los efectos asociados al crecimiento del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Este efecto está asociado a una inhibición de la actividad de unión de AP-1 al DNA, un aumento en la expresión de MyoD, y una disminución en la proteólisis muscular. El tratamiento con GW1929, agonista de PPARy, induce una recuperación en el peso de los músculos extensor digitorum longus de ratones portadores de carcinoma pulmonar de Lewis, asociado a un restablecimiento de los niveles de MyoD. Este compuesto también induce una disminución en la proteólisis de estos músculos in vitro. La sobreexpresión de Tam67, dominante negativo de AP1, revierte totalmente los efectos causados por la adición de TNF-a al medio de cultivo de mioblastos C2C12 en diferenciación. Este efecto es producido por el restablecimiento dei programa de diferenciación muscular, mediado por una disminución de ciclin_élDJ,una recuperación de los niveles de MyoDy unaumentode la proteínaMHCen estas células. La transferencia génica in vivo de dominante negativo de AP-1 Tam67 mediante adenovirus, produce una recuperación en el peso de los músculos y una atenuaciónen la caída de los niveles de MyoD en el músculo gastrocnemius de anima 8 lesporta 1a1 dores de tumor.

Autor: MARTRAS DELGADO SÍLVIA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: El ácido retinoico, en sus formas todo-trans- y 9-cis, actúa como ligando de receptores nucleares específicos, y es esencial en procesos de crecimiento, desarrollo y mantenimiento epitelial. La vía de formación del ácido retinoico incluye dos pasos de oxidación, de retinol y retinal, y de retinal a ácido retinoico. Se han descrito varias enzimas que pueden participar en el primer paso, cómo las ADH y las RDH, pero se desconoce la contribución de cada enzima en el proceso. Se ha clonado, expresado y purificado ADH1B1, ADH2B2 y ADH4 humanas y, también ADH1 y ADH4 de ratón, que por primera vez, se han caracterizado en su forma recombinante. Se han determinado las constantes cinéticas de todas estas ADHs con todo-trans- y 7-cis-, 9-cis-, 11-cis- y 13-cis-retinol y los correspondientes retinales. En general, las ADH4 humanas y de ratón muestran constantes cinéticas similares, y son más eficientes que las ADH1. Todas las ADHs utilizan como sustratros tanto 11-cis-retinol como 11-cis-retinal, compuestos relevantes en el ciclo visual. Se ha observado que la ADH4 muestra especificidad para la oxidación de 11-cis-retinol sobre la reducción de 11-cis-retinal, una propiedad única entre todas las ADHs para cualquier pareja de sustratos alcohol/aldehído. Mediante métodos de simulación molecular, y colonación, expresión y caracterización del mutante de la ADH4 humana M141L, hemos demostrado que el residuo 141, situado en la región mediana del túnel hidrofóbico del sitio activo de la ADH, es esencial para definir esta especificidad de la ADH4 sobre las ADH1. La inmunolocalización de la ADH4 en el epitelio pigmentado y en muhcas capas de la retina apoya la participación de la ADH4 en diferentes reacciones con retinoides. La actividad citosólica de la ADH4 en el epitelio pigmentado puede ser complementaria a la actividad 11-cis-retinol deshidrogenasas de la RDH5, necesaria para completar el ciclo visual, y puede estar también implicada en la generación de ácido retinoico en las capas neuronales de la retina. Otra familia de retinoides está formada por derivados oxidados en en anillo cilohexeno, como por ejemplo los 4-oxo-,4-hidroxi- y 3,4-dideshidroretinol y los correspondientes retinales. A pesar de que son compuestos poco estudiados, se conoce que algunos derivados, como los ácidos 4-oxo- y el 3,4-dideshidroretinoico pueden interaccionar con receptores nucleares. Las cinéticas de las enzimas ADH1B1, ADH2B2 y ADH4 humanas, y también ADH1 y ADH4 de ratón, indican que el 4-oxo-retinal y el 4-hidroxi-retinol son los sustratos con una eficiencia catalítica mayor entre todos los retinoides, especialmente respecto a las AHD4, mientras que los 3,4-dideshidroretinoides presentan una actividad similar al a de los todo-trans-retinoides. Los datos obtenidos in vitro apoyan la existencia de una vía metabólica para la formación de los ácidos retinoicos oxidados en el anillo a partir de los correpsondientes retinoles, con la participación de la ADH. Finalmente, hemos comprobado que la presencia de Tween 80 provoca una disminución de la actividad que resulta en una aparente inhibición competitiva en las cinéticas de la ADH para el todo-trans-retinol, con un aumento de la Km y disminución de la eficiencia catalítica al aumentar la concentración de detergente. Esto implica que los valores reales de Km son muy inferiores a los publicados hasta el momento, tradicionalmente obtenidos en presencia de 0,02% de Tween 80. Así, las ADHs presentan valores de Km próximos a los de las RDH y, por lo tatno, la contribución en el metabolismo de los retinoides podría ser similiar para ambos sistemas enzimáticos. Hemos comprobado espectrofotométricamente y por HPLC, que el Tween 80 mantiene la estabilidad de la solución acuosa de retinoides, y que perm 8 ite obte 310 ner resultados reproducibles y comparables entre diferentes ADHs.

Autor: GIMFERRER MIGUEL IDOIA.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA . UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: Los linfocitos T son activados cuando reconocen a través de su receptor o TCR el péptido antigénico presentado por el Sistema Principal de Histocompatibilidad (MHC, Mayor Histocompatibility complex). Esta es la primera señal y ha de ser amplificada para una correcta activación de los linfocitos T (LT) Y esta amplificación es realizada por parejas ligando-receptor con función co-estimuladora, como B7- CD28, que dan la llamada segunda señal. Entonces la zona de contacto entre el LT Y la célula presentadota (APC) se denominada sinapsis inmunitaria (SI), y las moléculas accesorias y de señalización de ambas células se van reorganizando fo rmando una estructura denominada Complejo Supramolecular de Asociación o SMAC. CD6 pertenece a la superfamilia de receptores con dominios ricos en cisteínas tipo Scavenger (SRCR, Scavenger Receptors Cistein Rich). Se expresa en LT maduros e inmaduros, células de la Leucemia Linfática Crónica, un subtipo de células B denominado Bla y sistema nervioso central. Tradicionalmente ha sido descrito como un receptor con función co-estimuladora pero el mecanismo por el que realiza esta función no es conocido. Este trabajo de tesis doctoral pretende ampliar los escasos conocimientos existentes sobre esta proteína. Nuestros OBJETIVOS han sido: 1. Estudio de posibles asociaciones de CD6 con otros receptores linfocitarios. 2. Implicación de CD6 y CD5 (miembro de la misma SF-SRCR con el que tiene gran homología) en los procesos de activación linfocitaria. Estudiando su presencia en estructuras relacionadas en la activación como la sinapsis inmunitaria (SI) y los rafts, y la implicación de sus respectivos ligandos en estos procesos. 3. Posibles asociaciones realizadas por la región citoplasmática de CD6. 1. Estudio de posibles asociaciones de CD6 con otros receptores linfocitarios: Mediante estudios bioquímicos (co-inmunoprecipitación) y de biología celular (FRET y modulación) hemos detectado la asociación física de CD6 a CD5 y el complejo CD3/TCR y proponemos una posible asociación a otras dos moléculas con función de adhesión como son CD44 e ICAM-3. La asociación de CD6 con CD5 se produce tanto en linfocitos maduros como en timocitos. Esta proximidad física permite plantear la hipótesis de una posible coordinación de sus funciones durante los procesos de activación y diferenciación de los LT, dando señales similares y/o complementarias. La asociación física de CD6 al complejo CD3/TCR es independiente de la presencia de CD5, y convierte a CD6 en un co-receptor de este complejo capacitándolo para modular sus señales durante los procesos de activación linfocitaria. 2. Implicación de CD6 y CD5 en los procesos de activación linfocitaria: Realizamos estudios de formación de SI entre LT Y células presentadoras de antígenos (APC) y observamos que tanto CD5 como CD6 eran rec1utados a la zona de contacto entre los dos tipos de células de forma antígeno dependiente. Esto demostraba que ambos receptores eran rec1utados a la SI durante la activación de los LT. Estudios más detallados indicaron que ambos receptores se acumulaban en la zona central de la SI, así como el ligando de CD6 (ALCAM). Además también estudiamos la presencia de CD6 en los rafts, balsas lipídicas ricas en colesterol y esfingolípidos que tienen la capacidad de segregar proteínas implicadas con la señalización y que han demostrado ser importantes para la correcta activación de los LT. Dentro de este segundo objetivo también quisimos estudiar la implicación de los ligandos de CD5 y CD6 en los procesos de activación de los LT. Para ello utilizamos unas proteínas solubles formadas por los tres dominios extracelulares de CD5 y CD6 con capa 8 cidad de 1386 bloquear la interacción de estos receptores a sus respectivos ligandos. Entonces estudiamos como afectaba la presencia de estas proteínas a la maduración de la SI y observamos que la presencia de la proteína recombinante soluble (rs) CD6 (rsCD6) producía una inhibición de entre un 37 % Yun 46% de la proporción de SI madura. La presencia de rsCD5 o albúmina no afectaba a la maduración de la SI. Realizamos entonces estudios de proliferación con diferentes estímulos y también esta proteína demostró capacidad inhibitoria de forma dosis dependiente del estímulo proliferativo dado por AcMo anti-CD3 (OKT-3) y PHA. La proteína rsCD5 sorprendentemente también fue capaz de inhibir de forma dosis dependiente la proliferación inducida por OKT-3. Estos efectos inhibitorios no eran tóxicos pues dosis máximas de estas proteínas no fueron capaces de inhibir cultivos estimulados con Pokewit mitogen (PWM), células alogénicas (cultivo mixto) y superantigeno (SEA). Por tanto las interacción de CD5 y CD6 a sus respectivos ligandos es importante para la correcta activación de los LT Yla respuesta proliferativa a ciertos estímulos, demostrando tener capacidad inmunomoduladora. Hay que destacar que existen formas naturales soluble de CD5 y CD6 en suero de personas sanas y a niveles más altos en sueros de pacientes con procesos autoinmunes que podrían tener esta función inmunomoduladora. 3. Posibles asociaciones realizadas por la región citoplasmática de CD6: Mediante ensayos de doble híbrido detectamos la asociación de la región más C-terminal de CD6 con la subunidad A de la fosfatasa PP2A (PP2A-A) Yla proteína adaptadora syntenin-l. La interacción CD6-PP2A-A no la hemos podido demostrar aún en un sistema de células de mamífero, pero sí hemos detectado por ensayos de doble híbrido directos la interacción de esta subunidad reguladora con la zona de CD6 entre el aa A613 y P647. La proteína syntenin-l contiene una zona N-terminal seguida de dos dominios PDZ en tándem. Fue descrita por primera vez por su interacción con syndecan. Syntenin-l interacciona a través de sus dominios PDZ con los cuatro aa más C-terminales de las proteínas diana. Para esta interacción es necesaria la integridad de sus dos dominios PDZ, pero cada dominio de forma individual tiene predilección por un tipo de proteína. Así se ha descrito que syntenin-l podría hacer de puente entre dos proteínas uniendo cada una por un dominio PDZ. Además hay que destacar que syntenin-l también interacciona por su zona N-terminal con factores de transcripción como Sox-4. Nuestros resultados de ensayos de doble híbrido directos y precipitación demostraron que en la interacción CD6-syntenin-l participan los dos dominios PDZ de syntenin-l así como los aa más C-terminales de CD6. También esta interacción la demostramos en PBLs humanas así como el acúmulo de syntenin-l en la zona central de la SI co-localizando con CD3. Esta ínteracción entre CD6 y syntenin-lsugiere que syntenin-l podría funcionar como una proteína adaptadora uniendo CD6 al citoesqueleto de actina u otras proteínas señalizadoras y que podría estar implicada en el reclutamiento de CD6 a la zona central de la SI. CONCLUSIONES 1- El conjunto de resultados de este trabajo permiten concluir que el receptor linfocitario CD6 es responsable de interacciones relevantes para los procesos de activación y diferenciación linfocitaria. 2- CD6 está fisicamente asociado a CD5, lo cual sugiere que estos dos receptores pueden formar una unidad funcional compartiendo señales similares o complementarias. 3- CD6 está fisicamente asociado al complejo CD3/TCR de forma independiente a CD5. Esta asociación convierte a CD6 en un co-receptor de este complejo CD3/TCR y 10 capacita para modular las señales mediadas por este complejo. 4- CD6 y s ligando se acumulan en la zona central de la SI co-localizando con CD5 y el complejo CD3/TCR. Esta localización está de acuerdo con su capacidad potencial de modular la activación linfocitaria. 5- La región intracelular de CD6 ínteracciona con syntenin-l, una proteína con dominios PDZ. La demostración de la presencia de syntenin-l en la zona central de la SI sugiere que esta proteína funciona como una proteína adaptadora permitiendo la unión de CD6 al citoesqueleto o a proteínas señalizadoras durante la formación y/o maduración de la SI. 6- La forma recombinante soluble CD6 (rsCD6) ha demostrado tener capacidad inmunomoduladora. Esto demuestra la relevancia de las interacciones mediadas por este receptor en los procesos de activación linfocitaria y plantea la su posible utilidad terapéutica.

Autor: GONZÁLEZ ROCA EVA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: FACULTAT DE CIÈNCIES.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Autor: LLORENS TORRES FRANCESC JOSEPH.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: FACULTAT DE CIÈNCIES.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: El presente trabajo se incluye dentro de un amplio proyecto iniciado en el grupo del Dr. Itarte que trata de estudiar algunos de los procesos celulares en los que la proteína quinasa CK2 ejerce sus funciones. El proyecto se inició con la observación que en diferentes passos cromatográficos, durante la purificación de CK2 de hígado de rata, CK2 co-purificada con proteínas la separación de las cuales era muy díficil, identificadas posteriormente como la chaperona grp94 (endoplasmina) y el factor de inicio de la síntesis proteica elF2. Esta última interaccionaba con CK2 a través de las subunitats beta i gamma, y en ensayos de actividad CK2 en presencia de elF2beta, se producía un aumento de la Km de CK2 sobre beta-caseína. Estos trabajos así como datos aportados en la bibliografía donde se describía elF2beta como substrato in vitro de CK2 llevó la elaboración de la presente tesis, en la cual se ha caracterizado y se han explicado funcionalmente las interrelaciones existentes entre CK2 i elF2beta, tanto a nivel de interacción entre ambas proteínas, como a nivel de fosforilación de elF2beta, intentando profundizar en el papel que esta fosforilaciónpuede tener en la funcionalidad del proceso de síntesis proteica donde elF2 tiene un papel clave en su mecanismo de regulación. Los resultados indican que elF2beta interacciona in vitro e in vivo como CK2, tanto con sus subunidades aisladas como con la forma holoenzimática de la quinasa. Esta interacción se procure mediante el dominio C-terminal de elF2beta y el cluster de residuos básicos y el segmento de activación deCK2. La interacción elF2beta-CK2 repercute en la actividad CK2, produciéndose una inhibición de la actividad quinasa sobre otros substratos de CK2 como beta-caseína o calmodulina. A su vez CK2 fosforila in vitro e in vivo enlF2beta en las serinas 2 y 67. La mutación de estos centros provoca una inhibición parcial de la síntesis proteica en células Hela re-estimuladas con suero. Las serinas fosforiladas se encuentran en el dominio N-terminal de elF2b, el cual al ser eliminado por mutagénesis provoca graves defectos tanto en síntesis proteíca como en viabilidad celular. Se postula que dichos efectos pueden ser producidos por la eliminación del centro de anclaje para elF5 (la proteína GAP de elF2).

Autor: ARESTÉ CALERO M. CRISTINA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D¡HEBRON.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Autor: JURADO SÁNCHEZ SANDRA.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID [www.ucm.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La hipótesis de este trabajo de investigación es que las enzimas que participan en la vía del NO/GMPc en neuronas granulares de cerebelo de rata pueden estar sujetas a un mecanismo de regulación de sus niveles de actividad y cantidad de proteína, que dirigía una expresión diferencial en el transcurso del desarrollo. La estrecha relación existente entre los receptores de NMDA y la isoforma NOS I supone la posibilidad de una vía de modulación de la actividad y expresión de estas proteínas mediante compuestos farmacológicos que actúan a través de estos receptores (agonistas y antagonistas). Hemos caracterizado la expresión de las proteínas implicadas en la vía del NO/GMPc en el cerebelo de rata y en la neuronas en cultivo comprobando, no sólo la existencia de todas las proteínas de la vía objeto de estudio, sino un patrón de expresión diferencial de esta proteínas en el transcurdo del desarrollo. Además el tratamiento prolongado con NMDA produce un claro incremento de la actividad de la GCs estimulada con un donador de NO exógeno, el DEA/NO, y un aumento del mensajero de las subunidades que constituyen esta proteína. Hemos profundizado en el estudio del mecanismo molecular responsable de la regulación de la subunidad a2 de la GCs, poniendo de manifiesto que el NMDa aumentaba la estabilidad del mensajero de la subunidad a2, que hasta ese momento no había sido clonada, la cual presenta múltiples secuencias ricas en uracilo relacionadas con la unión a proteínas implicadas en la estabilización/desestabilización de mensajeros como AUF1 y HuR. Finalmente demostramos que el tratamiento con NMDA disminuye la expresión de AUF1 de forma significativa a través de un mecanismo dependiente de PKG.

Autor: SANTAMARÍA MARGALEF ANNA.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: HOSPITAL VALL D'HEBRÓN - CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICAS.

Resumen: La presente tesis doctoral se divide en 3 partes: La primera parte y central, analiza las caracterización funcional de la proteína PTOV1. Dicha proteína fue hallada en un experimento de differential display realizado con muestras de adenocarcinoma prostático y muestras normales. PTOV1 se halla sobreexpresada en cáncer de próstata (CP) y en lesiones de PIN. PTOV1 es necesaria para la proliferación celular. Cuando se sobreexpresa, como ocurre en CP, las células entran en estado proliferativo. Además la sobreexpresión de PTOV1 en tumores también se correlaciona con una mayor estado proliferativo de éstos. PTOV1 interacciona con Flotillin-1, proteína mayoritaria delos lipid rafts no caveolares. PTOV1 parece ser necesaria para la entrada a núcleo de Flotillin-1. La sobreexpresión de Flotillin-1 también induce la proliferación celular y ambas parecen depender de la recíproca en su actividad mitogénica. Flotillin-1 parece también intervenir en mecanismos reguladores de la mitosis. Por otro lado, PTOV1 induce un aumento de la capacidad invasiva de las células in vitro. La sobreexpresión e PTOV1 induce un aumento de los niveles de las proteass del sistema del plasminógeno uPA y uPAR. PTOV1 interacciona con la proteína RACK1. Ambas se translocan a la membrana bajo la estimulación con IGF-1 o PMA. Ambas podrían participar en procesos de polarización y/o migración celular. La segunda parte de la tesis, aborda el estudio de la proteína Clusterin 1 y su papel inductor de la apoptosis en la línea tumoral prostática PC-3. Se analiza con detalle los efectos que promueve una forma intracelular de la proteína transfectada tanto de forma transitoria como estable en dicha línea celular. La sobreexpresión de la forma nuclear de Clusterin1 induce el arresto en G2/M y la apoptosis celular. Por último, la tercera parte de la tesis, aborda es estudio de los efectos antiproliferativos de los exactos de Pygeum africanum sobre líneas tumorales prostáticas así como sobre explantes procedentes de hiperplasia benigna de próstata.