ENZIMOLOGIA

Autor: AVILÉS PUIGVERT MONTSERRAT.
Año: 2003.
Universidad: GRANADA [www.ugr.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: HOSPITAL COMARCAL DE MOTRIL.

Resumen: La hipertensión arterial produce una afectación vascular sistémica, involucrando a diferentes órganos diana, entre ellos, el riñón y la retina. La nefropatía hipertensivas es una nefroangioesclerosis que cursa con lesiones en las arteriolas aferentes y eferentes renales. En la retinopatía hipertensiva se afecta la microvasculatura retiniana manifestándose con diferentes cuadros clínicos dependiendo de las características de la hipertensión arterial (forma de presentación, edad, control, años de evolución, â¦), sus efectos sobre el lecho vascular subyacente, y la vía etiopatogénica de lesión sobre el mismo. Existen múltiples marcadores bioquímicos séricos y urinarios de función renal que se determinan habitualmente, y otros, no habituales, detectados en orina, considerados actualmente como marcadores precoces de daño renal, como es el N-Acetil-Beta-Glucosaminidasa, que es la base de nuestro estudio. En los objetivos del mismo, además de estudiar los parámetros clásicos de función renal, y la actividad urinaria del NAG, se busca la correlación entre ambos, todo ello en relación con el grado de retinopatía hipertensiva. No encontramos la correlación que buscábamos entre el grado de afectación de la retinopatía y la excreción urinaria del NAG, considerando que el mecanismo de producción de la lesión en los distintos órganos puede ser diferente y no coincidir el estadió evolutivo (daño en la vasculatura renal más precoz con respecto al retiniano).

Autor: ARANAZ CORRAL INMACULADA.
Año: 2004.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID [www.ucm.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CC. QUÍMICAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE ESTUDIOS BIOFUNCIONALES DE LA UCM.

Resumen: En esta tesis se ha obtenido un biocatalizador inmovilizado a partir de un extracto celular de Agrobacterium radiobacter para la síntesis de un D-aminoácido de interés industrial, la p-hidroxifenilglicina (p-HPG). El extracto celular contiene dos actividades enzimáticas, D-hidantoinasa y D-carboamilasa, que transforman el sustrato de partida, la p-hidroxifenil-hidantoina, en el producto final, p-hidroxifenilglicina. Como soportes para la inmovilización, se han utilizado polímeros de origen natural; quitina y quitosano obtenidos a partir de deshechos de la industria pesquera y alginato de origen comercial. Se han ensayado tres métodos de inmovilización, la inmovilización coavalente, por adsorción y la encapsulación. En los dos primeros, se ha estudiado el efecto de las características físico-químicas de la quitina y del quitosano. En el tercer método, se han preparado complejos polielectrolitos de alginato-quitosano en los que se ha estudiado el efecto del modo de preparación y de las características del quitosano empleado (peso molecular y grado de acetilación). En todos los métodos ensayados, se han obtenido derivados que presentan ambas actividades enzimáticas y por tanto válidos para la síntesis de p-HPG. En todos los casos, los derivados se han optimizado modificando distintas variables de la reacción, tamaño de soporte. Los derivados optimziados se han caracterizado con respecto al efecto de la temperatura y pH en su actividad y estabilidad, reutilización y estabilidad durante el almacenamiento. De los soportes estudiados, la quitina ha dado mejores rendimientos que el quitosano tanto en la inmovilización covalente como en la inmovilización por adsorción. De las quitinas estudiadas la obtenidas a partir de caparazón de gambas (Ploeticus mülleri) y de langostino (Penaeus caramote) han presentado los rendimientos más elevados. Los derivados obtenidos por adsorción o por enalce no son recomendados para su empleo ya que en los primeros se produce desorción de las proteínas inmovilizadas con el tiempo y en los segundos la reacción de inmovilización afecta a un residuo catalítico y por tanto se obtiene bajo rendimiento. Los derivados encapsulados presentan los mejores rendimientos y además es posibles reutilizar el biocatalizador.

Autor: BAYES PUIG ÁLEX.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: Estudio de las propiedades exnimológicas de la smetalocarboxipeptidasas del tracto digestivo de los lepidópteros. Especialmente se ha caracterizado la procarboxipeptidasa a de Helicoverpa armgera i la procarboxipeptidasa B de Helicoverpa ze., Ambas desde un punto de vista estructural i funcional. En este trabajo se caracterizan por primera vez los canbios a nivel de estructura tridimensional de proteínas que las convierten en insensibles a inhibidores específicos.

Autor: Gandía Herrero Fernando.
Año: 2004.
Universidad: MURCIA [www.um.es].
Centro de lectura: Facultad de Biología. Universidad de Murcia.
Centro de realización: Facultad de Biología.

Resumen: La presente Tesis Doctoral, con mención de Doctorado Europeo, recoge los trabajos desarrollados en la caracterización de los pigmentos vegetales betalaínas y en la elucidación de las rutas biosintéticas conducentes a su formación. Se describen nuevas reacciones en el metabolismo de estos pigmentos hidrosolubles de interés alimentario, proponiéndose un nuevo esquema biosintético. Se pone de manifiesto la relevancia de la enzima tirosinasa, la cual es capaz de catalizar con una alta afinidad la hidroxilación de betaxantinas monofenólicas. Así mismo, se describe la transformación de betaxantinas difenólicas en formas leuko análogas a la betacianina betanidina, la cual también se describe como substrato de tirosinasa. Una de las características más intrigantes de esta enzima es su capacidad de existir en un estado inactivo o latente. Tirosinasa puede ser activada por una variedad de tratamientos o agentes, incluyendo la inducción de cambios en su estructura por la presencia del detergente aniónico dodecil sulfato sódico (SDS) y por proteolisis parcial. En este sentido, se describe la presencia de formas latentes de tirosinasa en una fuente formadora de betalaínas y se describe pormenorizadamente el fenómeno de activación. Ello lleva a evidenciar la existencia de un mecanismo común en la activación mediada por detergentes y proteasas y permite el desarrollo de nuevo modelos cinéticos. La caracterización de la actividad de tirosinasa sobre diversas betalaínas se basa en el desarrollo de protocolos para la síntesis, extracción y purificación de estos pigmentos. Ello lleva, además, a estudiar sus propiedades fisiquicoquímicas, poniendo de manifiesto la existencia de fluorescencia visible en betaxantinas. Todas las especies analizadas muestran un comportamiento similar, con máximos de excitación comprendidos entre 463 y 475 nm y máximos de emisión comprendidos entre 506 y 515 nm. En base a estas propiedades se desarrolla un nuevo método de análisis de betaxantinas en mezclas complejas a través de detección por fluorescencia y se utiliza un sistema de filtros para observar la contribución de la fluorescencia en las estructuras que las contienen. En análisis comparativo de los espectros de bataxantinas y betacianinas revela un solpamiento entre el espectro de emisión de las primeras y el de absorbancia delas últimas. esta situación provoca, cuando ambos tipos de pigmentos están juntos, la atenuación de la fluorescencia en un proceso fisiológico de efecto de filtro interno.

Autor: WILSON SOTO LORENA.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS. DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULA.
Centro de realización: INSTITUTO DE CATALISIS Y PETROLEOQUIMICA. CSIC..

Resumen: En este trabajo se han preparado agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs) de diferentes enzimas, con el fin de (1) aumentar la estabilidad enzimática, (2) estabilizar estructuras cuaternarias, (3) preparar CLEAs encapsulados en geles de alcohol polivinílico (PVA) y (4) desarrollar un nuevo tipo de biocatalizador, denominado CLEA con microambientes. Este nuevo biocatalizador combina las buenas propiedades del CLEA con las propiedades de un microambiente hidrofílico, lo que permite aumentar la estabilidad de las enzimas en presencia de codisolventes y modular sus propiedades catalíticas. Se prepararon CLEAs de penicilina G acilasa (PGA), logrando obtener un catalizador con 700UI/g de actividad específica que es un valor muy alto comparado con otros derivados de la enzima preparados sobre un soporte sólido. Estos CLEAs presentap mayor estabilidad térmica que la enzima soluble y que la enzima inmovilizada sobre soporte Eupergit. Estos derivados permitieron también estabilizar las complejas estructuras de enzimas multiméricas, con un protocolo de preparación muy simple. Se prepararon CLEAs de dos catalasas (enzimas tetraméricas) y se observó la estabilización de la estructura de ambas enzimas y además estos derivados resultaron tener una mayor estabilidad térmica que la enzima soluble y de aquellas inmovilizads en soporte glioxil agarosa. La encapsulación de CLEAs de PGA en matrices de polímeros más rígidos compuestos de alcohol polivinilico(LentiKats®), permitió obtener un nuevo catalizador denominado LK-CLEA con mejores propiedades mecánicas comparados con los CLEAs. Además, estos LK-CLEA muestran una alta estabilidad en presencia de codisolventes( el LK-CLEA mantiene el1 00% de su actividad mientras el CLEA ha perdido el 50% de su actividad inicial, después de 9 horas en 75%(v/v) de dioxano). Estos resultados son consistentes con el mecanismo propuesto de exclusión del codisolvente desde el'LentiKats, lo cual fue también comprobado por estudios de partición de dioxano entre el medio externo y el LentiKats. Los LK-CLEA son particularmente útiles para la síntesis de antibióticos (1-lactámicos (Cefalosporina G) en altas concentraciones de codisolvente, alcanzando mayores rendimientos de síntesis termodinámica y cinéticamente controlada, comparado con el CLEAs sin encapsular; esto podría ser debido a una partición de sustratos (mas hidrofilicos) hacia el interior del LentiKats, y de productos (hidrofóbicos) fuera de él. Se preparó un nuevo CLEA, denominado CLEA con microambientes(CLEA-OP), en el cual la enzima soluble fue precipitada en presencia de polietilenimina(P) y dextrano sulfato (O). La preparación de estos nuevos derivados consideró estudiar polímeros con diferentes masas moleculares y diferentes proporciones polímeros-enzima. Los CLEA-OP presentaron mayor estabilidad en medio orgánico (t1/2 230 h; 4°C 75%(v/v) dioxano) que la PGA inmovilizada en soporte Glioxil agarosa (t1/2 47,5 h); sin embargo la estabilidad térmica de los CLEA-OP fue menor (a 50°C en medio acuoso) , lo cual permite concluir que la estabilidad del CLEA-OP en medio orgánico es debido al microambiente hidrofílico que rodea a la enzima más que a una rigidificación del catalizador. Esto fue comprobado por experimentos de solvatación que mostraron una preferencial hidratación de los CLEAs-OP. Estos catalizadores con un microambiente altamente hidrofílico permitieron obtener altos rendimientos de síntesis termodinámicamente controlada de cefalosporina G (97%) Y mejoran el comportamiento de la enzima en reacciones de síntesis cinéticamente controlada en altas concentraciones de dioxano Finalmente se prepararon 8 CLEAs d 44d e lipasa de Alcaligenes sp. (CLEA-QL) y de Candida antarctica B (CLEA-CAB), con diferentes microambientes (de P y O) Y estos catalizadores se evaluaron en reacciones de hidrólisis de sustratos quirales para evaluar la modulación de las propiedades catalíticas según el microambiente del catalizador. Se observaron cambios significativos en la enantioselectividad de la enzima dependiendo del microambiente del que estaba compuesto el CLEA. Así por ejemplo, el CLEA-QL en la hidrólisis del (R,S) butirato de glicidol, varió su enantioselectividad de 4 a 14,2.Además se pudo comprobar que también estos CLEAs con microambientes de lipasa presentaban una alta estabilidad en presencia de codisolventes.

Autor: MOLDES MOREIRA DIEGO.
Año: 2004.
Universidad: VIGO [www.uvigo.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: DPTO. DE INGENIERÍA QUÍMICA UNIVERSIDAD DE VIGO.

Resumen: Se han producido los enzimas ligninolíticos manganeso peroxidasa y lacasa, mediante cultivo de los hongos de putrefacción blanca Phanerochaete chrysosporium y trametes versicolor. Los medios de cultivo suelen incluir residuos lignocelulósicos que permiten una inducción de la producción enzimática. Los enzimas producidos de esta forma se han empleado como agentes de la degradación de colorantes, que por su variedad y similitud con multitud de compuestos xenobióticos, se pueden considerar contaminantes modelo. De este modo los estudios de decoloración permitén obtener información acerca de la capacidad de degradación de constaminantes mediante enzimas ligninolíticos. Con phanerochaete chysosporium se realizaron estudios de decoloración in vivo e in vitro. En los estudios de decoloración in vivo coexistente procesos de degradación enzimática y de adsorción. Mediante decoloración in vitro se puso a punto un método de docoloración con adiciones de manganeso peroxidasa y peróxido de hidrógeno que permite mejorar los resultados de decoloración,así como un tratamiento continuo en el tiempo. En diferentes estudios de decoloración con el enzima lacasa de Trametes vesicolor se llegó a la conclusión de que el modo de producicón de dicho enzima influye sobremanera en la capacidad de decoloración del líquido extracelular producido. Las diferencias obtenidas se deben a factores enzimáticos y no enzimáticos. El factor no enzimático hace referencia a las sustancias de bajo peso molecular producidas en los cultivos, capaces de producir la decoloración de ciertas estructuras por sí mismas. Esta actividad está mediada paor la presencia de peróxidos producidos por los propios hongos. El factor enzimático viene dado por la diferencia de composición del complejo enzimático producido, en concreto, por la diferencia en la proporción de isoenzimas lacasa presente en cada tipo de cultivo. Se pudo llegar a esta conclusión tras realizar estudios de identificación de los isoenzimas producidos, purificación y cuantificación de los mismos, así como uan posterior relación entre dicha proporcióin de isoenzimas y la capacidad de decoloración . Se han empleado también los isoenzimas purificados de lacasa para realizar estudios de decoloración con los sistemas lacasa- mediador, gracias a los qu lacasa produce degradaciones más rápidas e incluso amplía el rango de productos oxidables. La aplicación de diversos mediadores resulto muyn efectiva en cuánto a la rapidez de decoloración, así como el grdo de decoloración observado. En capacidad de mediación se apreció el siguiente orden, para los mediadores empleados: PZ MAYOR NNDS MAYOR HBT MAYOR MAYOR ApHB. La adición d eun mediador en una reacción de degradación con lacasa también puede modificar el mecanismo de reacción producido. Así, el colorante rojo fenol produce polímeros en su reacción con lacasa, pero si se añade el mediador HBT, el sistema lacasa -HBT consigue una mayor degradación del rojo fenol sin producir este tipo de compuestos. Finalmente se estudió el efecto del biocida pentaclorofenol en cultivos de Trametes versicolor. Este compuesto produce una inducción de la actividad lacasa extracelular, paro el efecto se produce además a nivel de transcripción genética, tal y como se demostró mediante la técnica RT-PCR.

Autor: Monegal Granados Ana.
Año: 2004.
Universidad: RAMÓN LLULL [www.url.edu].
Centro de lectura: Escuela Técnica Superior IQS.
Centro de realización: Escuela Técnica Superior IQS.

Resumen: Las glicosiltransferasas son los enzimas responsables de la biosíntesis de glicoconjugados. Sus implicaciones en biomedicina las ha convertido en dianas muy atractivas para estudios estructura-función. La -1,3-galactosiltransferasa, objeto de la presente tesis, es la responsable de la síntesis del disacárido terminal Gal 1,3Gal-, el antígeno mayoritario en el xenotransplante. En la actualidad, la disponibilidad de órganos humanos para transplantes supone un grave problema dada la creciente demanda de órganos y la escasez de donantes. El xenotransplante, o transplante de órganos animales a humanos, podría ser una solución transitoria a este problema. Sin embargo, el mayor inconveniente del xenotransplante es el rechazo hiperagudo causado por la respuesta del sistema inmunitario a antígenos específicos de los tejidos animales. El antígeno mayoritario es el epítopo Gal o xenoantígeno, que se expresa abundantemente en la superficie de las células endoteliales de todos los mamíferos, excepto los humanos y los monos del viejo mundo. El epítopo Gal es producido por el enzima -1,3-galactosiltransferasa ( 3GT). Se han propuesto diferentes estrategias para evitar el rechazo hiperagudo: a) manipulación genética de los animales donantes (cerdos), para que produzcan órganos que no expresen el epítopo, b) neutralización de los anticuerpos naturales humanos con estructuras sintéticas que contengan el epítopo, c) eliminación de los anticuerpos previo al transplante, d) bloqueo del substrato aceptor por sobreexpresión de otras glicosiltransferasas en el animal donante, y e) inhibición de la actividad enzimática 3GT en el tejido a transplantar. El objetivo de este trabajo es la caracterización molecular de la 3GT bovina. La investigación se centra en el estudio estructura-función de su mecanismo catalítico, utilizando ingeniería de proteínas y técnicas de enzimología. Con esta finalidad se clonó el dominio catalítico de la 3GT y se expresó en E.coli. Se desarrollaron y validaron diferentes ensayos de actividad para caracterizar el enzima wt. Entonces, de acuerdo con la estructura cristalográfica de la proteína, se realizó un análisis mutacional en diferentes posiciones seleccionadas como candidatas a participar en catálisis o unión a los substratos. Estos mutantes fueron caracterizados cinéticamente y uno de ellos, que resultó inactivo, se estudió en profundidad sometiéndolo a experimentos de rescate químico para recuperar su actividad.

Autor: PARDO HONRUBIA ALEJANDRO.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: INSTITUTO DE CATALISIS Y PETROLEOQUIMICA.
Centro de realización: INSTITUTO DE CATALISIS Y PETROQUIMICA (CSIC).

Resumen: Introducción. Actualmente el interés por el H2 como vector energético es muy grande debido al incremento de las emisiones de CO2 en la atmósfera producido por la utilización de combustibles fósiles y sus posibles consecuencias en el cambio climático. Desde hace millones de años muchos microorganismos generan energía en su metabolismo por oxidación de H2. Los seres vivos explotan sus recursos energéticos mediante sofisticados catalizadores: las enzimas. Las hidrogenasas son las enzimas que catalizan la oxidación reversible de la molécula de H2. La alta eficiencia de estos catalizadores es aprovechada por muchos microorganismos en la naturaleza para obtener energía a través de rutas metabólicas, o para eliminar de un exceso de protones y electrones [Cammack R., 2001]. Desde el punto de vista tecnológico, las hidrogenasas tienen aplicación en el desarrollo de reactores de producción de H2 y pilas de combustibles [Albracht S.P.J., 1994; Cammack R., 2001; Mertens R. y cols., 2004], por lo que el conocimiento estructural y funcional de las hidrogenasas es fundamental para el avance de estas aplicaciones. Por otro lado, la química computacional (Modelización Molecular) es una aplicación informática para la simulación de procesos químicos y caracterización de compuestos químicos mediante modelos moleculares. Actualmente, es una herramienta muy potente al servicio de la química experimental ya sea como complemento y apoyo de resultados experimentales, o en otros casos para obtener resultados que la química experimental no es capaz de obtener o difícilmente puede hacerlo por problemas de complejidad, costes, tiempo, limitación tecnológica o peligrosidad de los experimentos. En la realización de parte de esta tesis, ha sido necesaria la utilización de métodos computacionales ya que se hace plausible la necesidad de abordar cuestiones mediante estos métodos, que las técnicas experimentales por si solas no han podido responder de forma clara hasta el momento. Objetivos. El objetivo fundamental que ha llevado a la realización de esta tesis, ha sido profundizar en el conocimiento electrónico-estructural y funcional de las hidrogenasas de NiFe. Para alcanzar este objetivo y, a tenor de lo presentado en la introducción sobre lo que se conoce y queda por conocer a cerca de este tipo de hidrogenasas, se han planteado una serie de objetivos más específicos que han tocado diferentes aspectos de estudio de las hidrogenasas de NiFe: -Caracterización estructural del los diferentes estados redox del centro activo detectados espectroscópicamente de las hidrogenasas de NiFe. -Caracterización electrónica de los estados de oxidación del Fe y Ni en las formas detectadas espectroscópicamente -Caracterización de la funcionalidad del centro activo en la ruptura de la molécula de H2. -Caracterización del transporte de protones entre el centro activo y el entorno de la proteína. -Caracterización funcional de los procesos de activación e inactivación. El conjunto de estos objetivos parciales propone una visión bastante completa de lo que acontece en las hidrogenasas de NiFe durante la actividad catalítica, concretamente en el centro activo y sus alrededores, con el fin de contribuir al avance y mejor conocimiento de estas hidrogenasas. Conclusiones. Las conclusiones fundamentales finales obtenidas a partir de los resultados y discusiones realizadas en esta tesis se resumen en los siguientes puntos: "El estado de oxidación del Ni en las formas no detectables en EPR es un estado Ni (II) alto espín. "El mecanismo de ruptura de la molécula de H2 se produce a través de un mecanismo de ruptura heterolítico, con la participación del Fe como centro receptor de la molécula de H2. Además, este proceso se ve favorecido cuando el centro activo es capaz de oxidarse por pérdida de un electrón. "La transferencia de protones entre el centro activo y el entorno de la proteína implica la participación del ácido glutámico (Glu-25 en D. fructosovorans, y Glu-18 en D. gigas) en los procesos de producción y consumo de H2. "Se propone que la diferencia entre las formas Ni-A y Ni-B es que la primera presenta u 8 n ( OH- 4a0 ) y un grupo sulfenato (S=O), mientras que la segunda sólo contiene un ( OH-), siendo la etapa limitante del proceso de activación de la forma Ni-A la conversión de los grupos ( OH-) y (S=O) a un grupo ( O2H-); hacen falta másresultados experimentales para confirmar esta hipótesis. Probablemente, la etapa limitante para el proceso de inactivación de la forma Ni-B se debe a la estabilización de una molécula de H2O por el ácido glutámico (Glu-25 en D. fructosovorans, y Glu-18 en D. gigas), la cual debe entrar en el centro activo para dar lugar al ( OH-).

Autor: SOSA AZUL M. JOSÉ.
Año: 2004.
Universidad: EXTREMADURA [www.unex.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: En el presente trabajo se ha estudiado la evolución de la población microbiana y diferentes parámetros fisicoquímico s(humedad, actividad del agua y cloruros) en el interior del jamón curado, comprobándose que dichos parámetros no se ven afectados por el factor nivel de engrasamiento de los perniles. En el interior del jamón curado se desarrolla una población microbiana que se mantiene a lo largo de todo el procesado, estando constituida principalmente por micrococáceas, levadura y lactobacilos. Se han aislado microorganismos a lo largo del procesado de los jamones y se ha estudiado sus actividades enzimáticas. Así, la población microbiana aislada durante las primeras fases del procesado posee mayor actividad proteolítica y lipolítica, coincidiendo con una menor disponibilidad de compuestos nitrogenados solubles y de ácidos grasos libres en el jamón. La actividad de aminasa de los microorganismos evaluados es fundamentalmente de tipo celular, en general poco selectiva frente a los diferentes aminoácidos, y más elevada en los aislamientos de secadero y bodega, donde hay una mayor presencia de aminoácidos libres. Se ha seleccionado un grupo de microorganismos aislados del interior del jamón curado para su posible utilización como cultivos iniciadores en piezas cárnicas maduradas de gran volumen, como el jamón curado. La selección se realizó de acuerdo con sus actividades enzimáticas "in vitro" para sus posterior en un sistema modelo cárnico madurado. Se observó que dichos microorganismos se desarrollan adecuadamente y presentan una actividad proteolítica y lipolítica superior a la actividad muscular residual. Estas actividades enzimáticas son dependientes del tipo de microorganismo. La presencia de los microorganismos aislados del interior del jamón curado sobre carne madurada, provocó además un aumento en la variedad y concentración de compuestos volátiles detectados durante la maduración, especialmente en los relacionados con el catabolismo de los aminoácidos, los cuales no tienen un gran impacto en las propiedades sensoriales de los productos cárnicos madurados. Atendiendo a la generación de precursores y de compuestos volátiles por los distintos aislamientos en carne madurada, y su posible complementariedad, se han propuesto algunos aislados (Staphylococcus xylosus Sxf01, Lactobacillus brevis Lbc05 y Debaryomyces hansenii Dhc01) para sus utilización como cultivos iniciadores en jamón curado.

Autor: Sidrach de Cardona Paniagua Lara.
Año: 2005.
Universidad: MURCIA [www.um.es].
Centro de lectura: Facultad de Química.
Centro de realización: Facultad de Química.

Resumen: Se ha abordado la purificación y la caracterización cinética de proteasas, peroxidasas y polifenoloxidasas, obtenidas a partir de residuos agroindustriales de alcachofa. El proceso de purificación de enzimas ha abarcado etapas de centrifugación, ultrafiltración y cromatografías de intercambio iónico, interacción hidrofóbica y filtración en gel, considerando su escalado hasta el nivel preparativo de planta piloto. El avance del proceso se ha comprobado mediante (SDS)PAGE e IEF, técnicas que también han permitidola determinación de masas moleculares y los valores de pH isoeléctrico de las isoenzimas purificadas, con satisfactoria recuperación y grado de purificación. A partir de los pistilos de alcachofa, se han obtenido tres aspártico proteasas o Cinarasas A, B y C. La primera es la más abundante y la segunda presenta la mayor actividad específica. Muestran actividad amidolítica e inhibición ante pepstatina, intermedias entre pepsina y quimosina. La actividad coagulante de la leche y la actividad proteolítica sobre caseínas, es similar a la de los cuajos de ternera y microbianos, por lo que pueden tener aplicación en la elaboración de cuajadas y quesos. Las brácteas de alcachofa contienen peroxidasa catiónica en estados penta y hexacoordinados, con distinta proporción de calcio enlazado. Se ha caracterizado la actividad y la estabilidad de esta peroxidasa ante calcio, peróxido de hidrógeno y disolventes orgánicos, optimizando las condiciones de ensayo para sus potenciales aplicaciones biotecnológicas, como análisis clínicos (glucosa, colesterol, inmunoensayos para virus, etc.), degradación de contaminantes fenólicos y síntesis de resinas fenólicas. También a partir de brácteas de alcachofa, se ha purificado tirosinasa o polifenoloxidasa, caracterizando sus actividades monofenolasa y difenolasa. La enzima actúa satisfactoriamente en medio acuoso, orgánico y ante tensoactivos, mostrando estéreoselectividad. Los ensayos de actividad y estabilidad han conducido hacia condiciones de reacción óptimas, para el desarrollo de posteriores estudios sobre sus posibles aplicaciones biotecnológicas en análisis, degradación y síntesis de fenoles.

Autor: GALLEGO MOLI ORIOL.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: Dep.de Bioq.y Biol. Molecular, U.A.B..
Centro de realización: Universitat Autònoma de Barcelona.

Resumen: Por primera vez, nuestro grupo identificó una enzima de la superfamilia de las aldo-ceto reductasas (AKR), la AKR1B12, activa con retinoides (Crosas et al., 2001). Dado que AKR1B12 presentaba una identidad secuencial próxima al 70% con las enzimas humanas AKR1B1 y AKR1B10, se decidió ampliar el estudio de la actividad retinoide oxidoreductasa entre las AKR. En la presente Tesis Doctoral, hemos profundizado en el estudio de la actividad retinal reductasa de miembros de la superfamilia de las AKR. El trabajo se inició con la caracterización in vitro de la actividad con retinoides de AKR humanas de la familia AKR1. En colaboración con el grupo de la Dra. Natalia Kedishvili (actualmente en el Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Schools of Medicine and Dentistry, University of Alabama at Birmingham, USA) se realizó un análisis comparativo de la actividad retinol oxidoreductasa de enzimas de las superfamilias de las deshidrogenasas/reductasas de cadena media (MDR), deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR) y AKR. Se utilizó un método nuevo basado en la solubilización de retinoides con BSA, y análisis mediante HPLC. Así, se determinaron los valores de las constantes cinéticas para enzimas humanas de las tres superfamilias sin el efecto inhibidor del Tween-80, un detergente utilizado tradicionalmente para el estudio cinético de MDR y AKR. Estos resultados mostraron que el valor de Km para retinoides es similar (0,1-1 ?M) en las enzimas estudiadas. Las principales diferencias se centran en el valor de kcat, el cuál varió hasta tres órdenes de magnitud entre las diferentes enzimas. Otro resultado destacable, fue la demostración de que ninguna de las enzimas era capaz de utilizar como sustrato retinol, o retinal, unido a la proteína unidora de retinol celular (CRBPI). Hasta el presente trabajo, se utilizaban dos argumentos para defender un papel principal de las SDR en la oxidación de retinol a retinal, primera etapa de síntesis del ácido retinoico: 1) Valores de Km inferiores de las SDR para los retinoides (hasta dos órdenes de magnitud inferiores respecto las ADH). 2) Capacidad para reconocer el holoCRBPI como sustrato, una propiedad aparentemente exclusiva de algunas SDR. Nuestro grupo, ha descartado estos dos argumentos y ha introducido las AKR como tercer grupo enzimático implicado en el metabolismo de retinoides. La segunda parte de la Tesis se centra en el estudio estructural y funcional de la AKR1B10, la AKR que presenta una mayor eficiencia catalítica para la reducción de retinal. Esta enzima se sobrexpresa en distintos tipos de cáncer humanos, lo que hizo aumentar nuestro interés en determinar su papel en la ruta de síntesis del ácido retinoico. Además del estudio in vitro de la actividad retinoide oxidoreductasa de la enzima, también se llevó a cabo un estudio in vivo. Utilizando células COS-1 como modelo, y mediante transfección transitoria, se pudo observar que AKR1B10 también participa en la reducción de retinal in vivo, pero en cambio no era capaz de oxidar retinol. Finalmente, y en colaboración con el grupo de cristalografía del Dr. Ignasi Fita (Parc Científic de Barcelona-CSIC), se obtuvo la estructura tridimensional del complejo AKR1B10- NADP+-tolrestat. El Tolrestat es un inhibidor de AKRB1 ampliamente estudiado como fármaco en el tratamiento de las complicaciones secundarias de la diabetes, pero que también inhibe AKR1B10 tanto in vitro como in vivo. Todo y la elevada identidad secuencial entre AKR1B1 y AKR1B10, estas enzimas presentan valores de constantes cinéticas muy diferentes para la reducción del retinal. Gracias a la resolución de la estructura de AKR1B10, esperamos poder estudiar los determinantes estruct 8 urales q 36b ue confieren a cada enzima sus propiedades cinéticas características, así como fijar las bases para el diseño de nuevos inhibidores específicos para cada una de ellas.

Autor: GARCÍA MURRIA MARÍA JESÚS.
Año: 2005.
Universidad: VALENCIA [www.uv.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MATEMÁTICAS - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: La Ribulosa 1 ,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) cataliza el primer paso en la fijación fotosintética del C02 a través del ciclo de Calvin. La estructura del holoenzima activo en organismos eucariotas es un hexadecámetro, compuesto por 8 subunidades grandes (de 51-58KDa) y 8 subunidades pequeñas (de 12-18KDa). En condiciones de senescencia natural o inducida por estrés la Rubisco sufre una degradación rápida y selectiva. Una de las respuestas más generalizadas ante diferentes tipos de estres en distintos organismos es la oxidación de grupos tioles de la Rubisco, que se ha relacionado in vitro e in vivo con la inactivación y susceptibilización proteolítica del enzima. Los residuos de cisteinas filogenéticamente conservados de la Rubisco son candidatos potenciales a mediar esta regulación redox. Con estos antecedentes, el objetivo general del presente trabajo ha sido evaluar la implicación de los residuos Cys172y Cys192 (altamente conservados en eucariotas y cianobacterias) en la actividad, modulación redox, y en la organización estructural del holoenzima. Para ello se han abordado los siguientes aspectos: I. Obtención y caracterización de las Rubiscos mutantes C172S, C192S y C172S/C192S: Las funciones de los residuos Cys 172 y Cys 192 se han investigado estudiando el fenotipo de mutantes en los que dichos residuos se han sustituido por serina mediante mutagénesis dirigida del gen rbcL en el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii.El enzima C1728 posee un factor de especificidad mayor que el silvestre, con unas constantes aparentes de Michaelis para el C02 y 02 aumentadas.La Rubisco C1928 presenta una especial sensibilidad a la inactivación por agentes modificadores de grupossulfhidrilo. Ello parece responder al caracter crítico de la modificación de la Cys172 en la actividad enzimática y alefecto protector que sobre este residuo ejerce la Cys192.El estudio del ensayo de la sensibilidad térmica, de los cambios en la sensibilidad proteolítica y de la movilidaddel holoenzima en geles nativos indica que la sustitución de las Cys 172 y/o Cys 192 afecta a la estructura de los enzimas. II. Determinacion de la estructura de las Rubiscos C172S y C192S por difraccion de rayos X:Se ha determinado la estructura tridimensional de la Rubisco de los mutantes C1728 y C1928. Como diferencia más significativa se ha detectado un desplazamiento de la hebra 131 del barril a/13 en el enzima C1728 en relación a la estructura del enzima silvestre. III. Estudio de la respuesta de los mutantes a diferentes tipos de estres:El mutante C 1728 sometido a estres salino degrada la Rubisco de forma mas lenta que la cepa silvestre o losde más mutantes. Además, bajo un estrés por diamida específicamente dirigido a la oxidación de los grupos sulfhidrilo,el mutante C1728 se muestra resistente a la inactivación que sufren las demás cepas. Ello apunta a un papel singulardel residuo Cys172 en la modulación del catabolismo de la Rubisco en respuesta asituaciones de estrés.En condiciones de estrés por diamida, todas las cepas mutantes (C1728, C1928 y C1728/C1928) presentan una degradación retardada de la Rubisco por comparación con la cepa silvestre. Ello sugiere que, en estas condiciones de oxidación directa de los tioles celulares, la formación de un puente disulfuro entre la Cys 172 y la Cys192 podría actuar como una serial condicionante de la degradación del enzima.

Autor: Larroy Hernando Carolina.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: Univ.Autónoma de Barcelona.
Centro de realización: Universidad Autónoma de Barcelona.

Resumen: En esta Tesis se presenta la identificación y caracterización de dos nuevas alcohol deshidrogenasas en la levadura Saccharomyces cerevisiae. se trata de dos enzimas que pertenecen a la macorfamilia de alcohol deshidrogenasas de cadena media, y concretamente a la familia de cinamil alcohol deshidrogenasas. Se trata de proteínas homodiméricas compuestas por subunidades de 40 kDa. Estas enzimas, Adh6p y Adh7p, presentan una actividad catalítica dependiente de NADP(H) y son capaces de oxidar alcoholes alifáticos lineales o ramificados y alcoholes aromáticos con o sin sustituyentes, a sus correspondientes aldehídos, siendo ésta una reacción reversible. De hecho, ambos enzimas presentan una mejor eficiencia catalítica frente a la reducción de aldehídos, pudiendose considerar su función como la de aldehído reductasas dependientes de NADP(H). Se ha determinado la estructura cristalográfica de Adh6p. La estructura mantiene los dominios característicos de las alcohol deshidrogenasas, un dominio estructural y un dominio de unión a coenzima, cada uno de ellos con un átomo de zinc. Entre ambos dominios se sitúa el centro catalítico donde el sustrato se coloca orientado hacia el átomo de zinc catalítico y la molécula de nicotinamida del cofactor. La estructura obtenida nos ha permitido postular que Adh6p funciona con un mecanismo catalítico de 'half-of-the-sites', de manera que sólo una de las dos subunidades sería activa en un ciclo catalítico. El estudio funcional de estas proteínas nos ha permitido observar que Adh7p prácticamente no se expresa en la célula de levadura. sin embargo, Adh6p se expresa durante la fase logarítmica del crecimiento y participa en funciones de desintoxicación de aldehídos derivados de la ligninolisis, de respuesta al estrés oxidativo, en la formación de alcoholes superiores y en el mantenimiento del balance redox NADP+/NADPH intracelular.

Autor: Lozada Ramírez José Daniel.
Año: 2005.
Universidad: MURCIA [www.um.es].
Centro de lectura: Facultad de Biología.
Centro de realización: Facultad de Biología.

Resumen: La presente Tesis Doctoral recoge los trabajos desarrollados en la clonación, sobreexpresión y caracterización bioquímica de la enzima S-adenosilhomocisteína hidrolasa y la consecuente síntesis del producto enzimático S-adenosilhomocisteína. En ella, se describe el desarrollo de un nuevo método de medida de la actividad, el cual es aplicable en la búsqueda y selección de microorganismos productores de la enzima. En la tesis se reporta por primera vez la clonación del gen que codifica para la síntesis de S-adenosilhomocisteína hidrolasa, a partir de microorganismos mesofílicos y termofílicos de interés industrial. También se reporta la expresión de las enzimas provenientes de dichas fuentes en altos niveles, su purificación y la caracterización bioquímica de las s-adenosilhomocisteína hidrolasas purificadas. La caracterización bioquímica ha permitido seleccionar a una de las enzimas recombinantes obtenidas en su posible aplicación como biocatalizador en la síntesis de S-adenosilhomocisteína, la cual ha sido utilizada en un bioreactor.

Autor: GOUVEIA CARLOTO ANTONIO MANUEL.
Año: 2005.
Universidad: EXTREMADURA [www.unex.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La ADP-ribosa libre es un nucleósido difosfoazúcar (NDP-azúcar) que tiene una ribosa con carácter reductor y es tóxico debido a su capacidad de reaccionar de forma no enzimática con cadenas laterales de proteínas. Recientemente se ha descrito que es un controlador de algunos canales iónicos. Las ADP-ribosa hidrolasas son potenciales agentes protectores que impiden la acumulación intracelular de ADP-ribosa. En mamíferos, se conocen dos tipos de enzimas con actividad ADP-ribosa hidrolasa: 1,- ADP-ribosa pirofosfatasas altamente específicas de baja Km (menor 1 uM) que de manera dependiente de MG2+ hidrolizan sólo ADP-ribosa y el análogo no fisiológico IDP-ribosa. 2,- Nucleósido difosfoazúcar o difosfoalcohol (NDP-X) pirofosfatasas menos específicas, que además de A(I)DP-ribosa hidrolizan otros sustratos NDP-X no reductores. En esta Tesis, describimos que extractos de placenta humana contienen dos ADP-ribosa hidrolasas, que fueron caracterizadas tras una purificación de unas 1000 veces. Una de ellas, es una ADP-azúcar pirofosfatasa: hidrolizó ADP-ribosa, ADP-glucosa y ADP-manosa, pero no por ejemplo UDP-glucosa, a velocidades similares. Se parece a una enzima previamente estudiada en eritrocitos humanos y a la expresada a partir de clones deNUDT5 humano, pero presenta una Km para ADP-ribosa 5-20 veces menor (7 uM). La otra es una ADP-ribosa pirofosfatasa altamente específica de baja Km (0,4 uM), siendo la primera enzima de estas características identificada en tejidos humanos. La enzima recombinante humana NUDT9, estudiada tras su expresión en E.coli, presentó propiedades similares a las de la ADP-ribosa pirofosfatasa de placenta, incluyendo el bajo valor de Km, lo que nos permitió establecer la identidad de ambas enzimas. Al ser incubadas conH2O2, tanto la ADP-ribosa pirofosfatasa purificada de placenta como NUDT9 presentaron una parente "cambio de especificidad de catión". La actividad de la enzima en presencia de Mg2+ 5mM se redujo unas 10-20 veces, pero aumentó en proporción parecida la actividad en presencia de Mn2+ 5mM. El fenómeno se acompañaba de una elevación de la Km de la ADP-ribosa pirofosfatasa para ADP-ribosa y parece debido a la generación de una forma "oxidada" dela enzima. Las ADP-ribosa hidrolasas purificadas de placenta pueden corresponder a los productos de los genes NUDT5 y NUDT9, que codifican proteínas pertenecientes a la superfamilia Nudix. Teniendo en cuenta su estricta especificidad y muy alta finidad por ADP-ribosa, la ADP-ribosa pirofosfatasa (NUDT9) puede tener un papel predominante previniendo la acumulación de ADP-ribosa libre en humanos. Esta podría ser también la función de la aDP-azúcar pirofosfatasa (NUDT5), ya que es posible que la ADP-ribosa sea su sustrato más relevante in vivo.

Autor: CIMA MARTIN SERGIO DE.
Año: 2005.
Universidad: LEÓN [www.unileon.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE LEON.

Autor: Peñalver Jara María José.
Año: 2006.
Universidad: MURCIA [www.um.es].
Centro de lectura: Facultad de Química.
Centro de realización: Universidad de Murcia.

Resumen: La caracterización cuantitativa del efecto isotópico del disolvente, sobre las actividades monofenolasa y difenolasa de tirosinasa, ha conducido a establecer las respectivas etapas determinantes de la velocidad, en ambas actividades. En la actividad monofenolasa se ha demostrado la liberación enzimática de difenol, en cantidades estequiométricas con la especie oxitirosinasa, con determinaciones directas mediante cromatografía de gases / espectrometría de masas, así como evidencias indirectas comprobando la estequiometría variable de la reacción, ante diversas condiciones de ensayo. Se han diseñado experimentos y simulaciones por integración numérica del correspondiente sistema de ecuaciones diferenciales, para comprobar la validez de diversos mecanismos de reacción alternativos. Se ha deducido la expresión analítica del Factor de Autoactivación de Velocidades (RAF), parámetro cinético útil para cuantificar la autoactivación catalítica en la actividad monofenolasa de tirosinasa. En conjunto, se ha demostrado la validez del mecanismo de reacción propuesto para la enzima tirosinasa por el equipo investigador, descartando erróneos mecanismos propuestos por otros autores. Además, se han determinado diversas constantes cinéticas que caracterizan las actividades monofenolasa y difenolasa, en tirosinasas de diversas fuentes biológicas.

Autor: Rodríguez Maynou Montserrat.
Año: 2006.
Universidad: GIRONA [www.udg.es].
Centro de lectura: Universitat de Girona.
Centro de realización: Universitat de Girona.

Resumen: En esta tesis se ha caracterizado la ruta de internalización de la onconasa, una ribonucleasa citotóxica. Los resultados indican que la onconasa entra en las células por vía dependiente de clatrina y del complejo AP-2. Seguidamente se dirige a los endosomas de reciclaje y es a través de esta ruta que la proteína ejerce su citotoxicidad. Por otro lado, los resultados de este trabajo demuestran que PE5, una variante de ribonucleasa pancreática humana (HP-RNasa) interacciona con la importina mediante diferentes residuos que aunque no son secuenciales, se encuentran cercanos en la estructura tridimensional de esta proteína. PM8 es una HP-RNasa con estructura cristalográfica dimérica cosntituida por intercanvio de dominios N-terminales. En esta tesis se han establecido las condiciones para estabilizar este dímero en solución y también se propone un mecanismo para su dimerización. Finalmente, se estudia el patrón de digestión de sustrato por parte de la HP-RNasa.

Autor: Martínez Martínez Irene.
Año: 2006.
Universidad: MURCIA [www.um.es].
Centro de lectura: Facultad de Biología. Universidad de Murcia.
Centro de realización: Facultad de Biología.

Resumen: Para llevar a cabo la desacetilación de la cefalosporina y sus derivados, la primera Ramnogalacturonan acetil esterasa (YesT) bacteriana, procedente de Bacillus subtilis, fue clonada y caracterizada. YesT fue capaz de actuar sobre sustratos cefalosporánicos y sobre el xilano, presentando un efecto sinérgico cuando actuaba en combinación con -xilanasa. El alineamiento de su secuencia primaria con otras proteínas reveló que YesT es un nuevo miembro de la familia de las SGNH hidrolasas. Presenta un plegamiento sándwich. El diagrama topológico de YesT puso de manifiesto la divergencia de todos los miembros de la familia SGNH hidrolasa desde un ancestro común. Esta divergencia parece haber ocurrido en dos líneas topológicas diferentes, en una de las cuales sus miembros presentan hojas adicionales a la hoja central. Además, una Acetil xilan esterasa procedente de Bacillus pumilus fue clonada y caracterizada sobre sustratos cefalosporánicos. Por otro lado, se desarrolló un método colorimétrico, basado en un indicador de pH, para evaluar las actividades Acetil xilan esterasa y Cefalosporin deacetilasa utilizando como sustratos 7-ACA, CPC y xilano. El método ha sido validado para su aplicación en high-troughput screening, permitiendo evaluar librerías procedentes de experimentos de evolución dirigida o metagenómica. Para modificar la posición 7 de la cefalosporina, una Glicina oxidasa procedente de Bacillus subtilis (GOXB) fue clonada y caracterizada. GOXB no fue capaz de actuar sobre la cefalosporina, por ello se generaron los mutante M261Y y M261H, poniendo de manifiesto la implicación de este residuo en la modulación de la especificidad de sustrato. Ambos mutantes presentaron una disminución en el valor de la KM sobre todos los sustratos analizados, pero no fueron activos sobre la cefalosporina. El mutante M261Y presentaba un valor de KM sobre el sustrato N-etil-glicina tan bajo que aventura una función similar a la descrita para la enzima N-alquil-glicina oxidasa que detecta N-carboxi-metil-lisina, que es un biomarcador en complicaciones derivadas de la diabetes. Con el objetivo de maximizar la expresión de GOXB se llevó a cabo el cultivo en alta densidad celular de la cepa Escherichia coli Rosetta (DE3). El proceso se llevó a cabo mediante el suministro de la fuente de carbono de forma exponencial aunque de manera limitante para evitar la acumulación de acetato. Las velocidades específicas de crecimiento de la cepa pudieron ser descritas y se optimizó la concentración celular óptima para llevar a cabo la inducción de la expresión de GOXB. Buscando nuevas actividades para GOXB, se sometió a técnicas de evolución dirigida mostrando la implicación en la actividad y especificidad de sustrato de uno de los residuos situados en la secuencia consenso de unión al FAD. El modelado estructural revela que la mutación de la Ile por Val, parece provocar un movimiento en el cofactor que permite un mejor acomodamiento en el centro activo de sustratos cíclicos, como la D-prolina y el D-pipecólico. Una Glicina oxidasa procedente del microorganismo extremófilo Geobacillus kaustophilus (GOXK) fue también clonada y caracterizada. Esta enzima presentó una amplia especificidad de sustrato, así como propiedades alcalofílicas y termofílicas. El modelado estructural mostró enormes similitudes con GOXB. Las principales diferencias parecen situarse en la interacción entre los monómeros. Sin embargo, el resultado más relevante es que GOXK es la primera glicina oxidasa capaz de actuar sobre la cefalosporina, abriendo nuevas posibilidades biotecnológicas para esta enzima.