GENETICA BIOQUIMICA

Autor: RIPOLL SAMPER JUAN JOSE.
Año: 2003.
Universidad: MIGUEL HERNÁNDEZ DE ELCHE [www.umh.es].
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ.

Resumen: Arabidopsis thaliana presenta excelentes propiedades como organismo modelo para llevar a cabo tanto estudios genéticos como moleculares de los procesos de desarrollo. El análisis del desarrollo del fruto en esta planta modelo está generando importantes progresos en la comprensión de este fenómeno. Con el objetivo de contribuir al entendimiento de este programa de desarrollo, llevamos a cabo un escrutinio de mutantes afectados en la morfología del fruto en una colección de líneas de inserción de T-DNA. Se aislaron diversos mutantes con frutos de apariencia anormal. Uno de ellos, denominado pepper1-1 (pep1-1), muestra un fenotipo pleiotrópico caracterizado por diversos rasgos entre los que destaca la aparición de más de dos valvas en los frutos. Las secciones transversales de frutos pep1-1 permiten observar tres o cuatro repla que delimitan a tres o cuatro valvas, respectivamente. Este fenotipo se transmitió a la progenie siguiendo un patrón recesivo característico y absolutamente ligado a la resistencia al antibiótico kanamicina, conferida por la presencia de T-DNA. Mediante I-PCR y TAIL-PCR se caracterizaron las regiones genómicas adyacentes a los bordes del T-DNA, encontrando secuencias pertenecientes alos cromosomas IV y V. Además, se comprobó que el locus PEP1 muestra ligamiento absoluto a marcadores SSLP de ambos cromosomas, lo que apunta a una translocación recíproca. Los resultados de hibridación Southern y la semiesterilidad que prsentan los heterocigotos pep1-1 se ecuentran en consonancia con dicho tipo de aberración cromosómica. Todo ello sugiere que el fenotipo de la splantas pep1-1 es consecuencia de una compleja combinación de funciones genéticas. No obstante, los ensayos de alelismo entre pep1-1 y diversas líneas de inserción en uno de los genes potencialmente afectados por la aberrción cromosómica muestran que dichas estripes mutantes no complementan, apareciendo frutos que presentan valvas extra. Los nuevos alelos (pep1-2 a pep1-5) presentan una única inserción de T-DNA en un gen que codifica un polipéptido con tres dominios de interacción con RNA de tipo KH. Este pertenece a una importante familia de 26 miembros en Arabidopsis y se encuentra muy conservado a través de la filogenia vegetal. La introducción de construcciones transgénicas portadoras de la versión silvestre del gen rescata el fenotipo silvestre en pep1-1, demostrando que las mutaciones en este gen son las causantes del fenotipo mutante observado. PEP1 se expresa en los órganos principales de la planta (raíces, tallos, hojas, flores y frutos), lo que es coherente con el grado de pleiotropía observado en sus mutantes. Mediante hibridación in situ se ha localizado el transcrito de PEP1 en las regiones periféricas del meristemo floral y en la región correspondiente al replum. Por otra parte, la sinteracciones genéticas sugieren que PEP1 participa en la morfogénesis de la planta a través de distintos procesos de desarrollo como la vía de transducción de señales CLAVATA, o la ruta autónoma de control del tiempo de floración. El producto de PEP1, una presunta proteína de unión a RNA, podría estar desempeñando un papel en la regulación postranscripcional de productos génicos importantes en estas rutas de desarrollo.

Autor: MUÑOZ MUÑOZ IVAN.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: FACULTAT DE VETERINÁRIA.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: Las fosfatasas de tipo Z , codificadas por los genes PPZ1 y PPZ2, desarrollan un papel importante en la biología de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En concreto, ejercen un control negativo sobre la tolerancia salina y la progresión del ciclo celular y positivo en el mantenimiento de la integridad celular. En el momento de iniciar este trabajo solo se conocía una subunidad reguladora de estas fosfatasas, conocida con el nombre de Hal3 o Sis2. Esta proteína actúa como inhibidora de todas las funciones concoidas de Ppz1. Sin embargo, su mecanismo de actuación es desconocido. El primer objetivo de la tesis ha sido intentar profundizar en la regulación que llevan a cabo las fosfatasas Ppz1 y Ppz2 en el control de ciclo celular de la levadura. Para ello se ha generado un doble mutante condiconal sit4 hal3 que presenta una parada entre las fases G1 y S del ciclo. Esta cepa se ha transformado con dos genotecas mutlicopia diferentes. Gracias a esto se han podido asilar una serie de genes que, en multicopia son capaces de suprimir el fenotipo de esta cepa. Entre ellos se encuentran elementos reguladores del ciclo celular ya conocidos, algunas fosfatasas, elementos involucrados en homeostasis salina y tres genes cuya función era desconocida por el momento, que han sido renombrados VHS1, VHS2 y VHS3. En segundo lugar, se ha investigado el mecanismo de acción de Hal3 sobre la fosfatasa Ppz1. Para ello se han estudiado elementos hallados en la secuencia de Hal3 posiblemente relevantes para la función de esta proteína. Además, se ha realizado una estrategia de mutagénesis al azar de la zona más conservada de Hal3 seguida de una búsqueda de pérdida de función. Esto ha permitido halalr una serie de cambios aminoacídicos únicos que interfieren en la función de Hal3. La caracterización bioquímica posterior ha permitido determinar dos regiones en la secuencia de HAl3 importantes para la unión a Ppz1 y una tercera región importante para inhibir a la fosfatasa. Finalmente, se ha estudiado el papel biológico de YFR003c, un ORF cuya función era desconocida por el momento. Estos estudios han demostrado que codifica una proteína con características afines a los inhibidores de la fosfatasa de tipo 1 humana. Además, se ha podido demostrar que Yfr003c es capaz de unirse e inhibir in vitro a Glc 7 (la subunidad catalítica de la fosfatasa de tipo 1 de la levadura) y, con menor eficiencia a Ppz1. Estudios posteriores in vivo refuerzan el papel de Yfr003c como inhibidor de Glc7, motivo por el cual ha recibido el nombre de Ypi1 (Yeast Phosphatase 1 Inhibitor).

Autor: IGLESIAS SERRET DANIEL.
Año: 2004.
Universidad: BARCELONA [www.ub.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSITAT DE BARCELONA.

Resumen: En la Tesis Doctoral se ha estudiado la regulación transcripcional y traduccional de genes implicados en el control del proceso apoptótico, así como las vías de transducciones de señales implicadas en su regulación. Se ha estudiado la regulación del gen Mcl-1, de la familia de Bcl-2, en la línea limfocitaria Jurkat durante la inducción de apoptosis por las drogas estaurosporina y aspirina. Las dos drogas inducen apoptosis por vías dependientes e independientes de la activación de las caspasas. La estaurosporina tiene efectos a nivel transcripcional y traduccional, mientras que la aspirina induce una parada de la sintesis proteica de la célula, al menos por fosforilación del factor eIF2alfa. Los resultados obtenidos indican que la desaparición de Mcl-1 puede ser necesaria, pero no suficiente, para inducir apoptosis en las células Jurkat. Hemos realizado las inserciones descritas en el promotor del gen Mcl-1 en células de leucemia linfática crónica de tipo-B (LLC-B), asociadas a incrementos de los niveles de mensajero y proteína, y aun mal pronóstico y progresión de la enfermedad. Los resultados obtenidos indican que dichas inserciones son un polimorfismo presente en la población y no parece estar asociado a un mal pronóstico en el diagnóstico. Se ha estudiado la regulación del gen BIM, de la familia de Bcl-2, en cultivos primarios de LLC-B durante la apoptosis inducida por diferentes drogas y durante el tratamiento por diversos factores de supervivencia. También se ha estudiado la región 5'-UTR del gen antiapoptótico XIAP, de la familia de las IAPs.

Autor: MAYOR OLEA ÁLVARO.
Año: 2004.
Universidad: MÁLAGA [www.uma.es].
Centro de lectura: FACUTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: DPTO. DIOQUÍMICA , FACULTAD MEDICINA.

Resumen: OBJETIVOS: Estudiar la implicación de distintos polimorfismos genéticos del Sistemas Renina Angiotensina (SRA):inserción delección (I/D)del gen de la Enzina Conversora de Angiotensina (ECA),el polimorfismo A1166C del gen del receptor AT1 de angiotensima y el polimordismo M235T del gen del angiotensinógeno, en la elección del tratamiento farmacológico de la Hipertensión Arterial (HTA). MÉTODO: Es un estudio retrospectivo basado en el análisis genético de 250 pacientes (58% mujeres)tratados en monoterapia (IECA o ARAII)con la HTA controlada a lo largo del tiempo.La respuesta a terapia antihipertensiva fue analizada en base al control de la HTA a lo largo del tiempo y de los distintos tratamientos de cada paciente fundamentada en su historia clínica y farmacológica. RESULTADOS:Con respecto al tratamiento con ARAII, no se hallaron diferencias estadísticas significativas en las frecuencias alélicas no genotípicas en ninguno de los polimorfismos estudiados. Los pacentes tratados con IECA mostraron diferencias significativas ( p mayor 0,05)en cuanto a la presencia del alelo D del polimorfismo I/D de ECA, siendo éste más frecuente en sujetos no respondedores (0,73)frente a respondedores (0,58).También se observan diferencias estadísticamente significativas en las frecuencias del genotipo II que resulto ser de 0,21 en respondedores y 0,05 en el grupo de pacientes no respondedores (p mayor 0,05).En cuanto al polimorfismo A1166C y M235T, no se observaron diferencias significativas ante la respuesta a los fármacos. CONCLUSIONES:Los polimorfismos A1166C del gen del receptor AT1 y M235T del gen del angiotensinógeno no son factores predictivos de la respuesta al tratamiento de la hipertensión esencial con ARAII ni con IECA en monoterapia.La determinación del genotipo del polimorfismo I/D de ECA será una herramienta útil en el futuro a la hora de escoger un tratamiento para la hipertensión esencial, siendo el tratamiento con IECA más beneficiosoo en los pacientes con genotipo homocigótico II.

Autor: HERNÁNDEZ RODRÍGUEZ CARMEN SARA.
Año: 2004.
Universidad: VALENCIA [www.uv.es].
Centro de lectura: BIBLIOTECA DEL CAMPUS DE BURJASSOT.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS-UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: Bacillus thuringiensis es el biopesticida mas utilizado en el mundo y la expresi6n de sus toxinas Ien plantas transgenicas ofrecen protección a los cultivos frente a plagas de insectos a lo largo dE todo el crecimientO de la planta. En la presente tesis se estudiala distribución de distintas tóxinas de B. thuringiensis en aislados de esta especie y se describió la interacción de estas con sitios de unión específicos en vesículas de membranas de distintos insectos plaga. El estudlo de la distribuciónn de ~b-exotoxina tlpo I reveló que este metabolito era producido por las cepas tipo de los serovares thuringiensis, tolworthi y darmstadiensis. Se encontró correlación de la producción o ausencia de exotoxina en determinados serovares de B. thuringiensis. En un estudio con aislados procedentes de Bolivia, se encontró B. thuringiensis en el 60% de las muestras procedentes de regiones productoras de patata en Bolivia. Los aislados mas tóxicos contra Spodoptera exigua y Phthorimaea operculella contenian cristales bipiramidales, una banda de 130 KDa y genes de las familias cryl y cry2. Entre estos aislados se identificó un gen cryl nuevo. La mayoria de los aislados procedentes de 4 colecciones establecidas a partir de habitats y tipos de muestras divers as contenian cristales bipiramidales. La presencia de cristales bipiramidales estaba relacionada con la amplificación de genes crylA y cry2, mientras que la presencia de cristales redondeados estaba asocidada con la ausencia de estos genes. La frecuencia global de genes crylA y cry2 fue del 61.5% y 59.2%, respectivamente, y se observó una tendencia de estos genes a aparecer conjuntaniente. En una colección de 507 cepas de B. thuringiensis, la frecuencia de genes vip fue de110% para genes viply vip2, y 49% para genes vip3. La estrategia de PCR-RFLP utilizada permiti6 identificar y clasificar estos genes vip en base a los diez patrones distintos encontrados. Dos patrones no esperados demostraron la presencia de dos genes vip nuevos pertenecientes alas familias vipl y vip3. Se demostró que la liofilización de intestinos de larvas de lepidópteros es un método otimo de preservaci6n que permite la realizaci6n de estudios de union de toxinas Cry de B. thuringiensis a vesiculas de membrana de intestino yes el metodo de conservacion mas adecuado para realizar envios de este material biologico. Estudios de union de toxinas Cry a vesiculas de membrana concluyeron que las toxinas d~ Cry1Ac, CrylFa y Cry1Ja comparten el sitio de unión en la membrana en Helicoverpa armigera, Helicoverpa zea y Spodoptera exigua. En estos insectos, no se ericontraron sitios adicionales de uni6n para Cry1Ac y Cry1Fa. Estos resultados,junto con experimentos previos, apoyan la idea de que las toxinas Cry1A, Cry1Fa y Cry1Ja tienen un sitio de unión comun en la mayoria de especies de lepidópteros.

Autor: BLANCH MOCHALES ÁLVARO.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: FACILTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El angioedema hereditario (HAE) es una enfermedad poco frecuente que se caracteriza por la recurrencia de edemas en el tejido subcutáneo o submucoso del tracto gastrointestinal y/o vias respiratorias superiores, y que resulta potencialmente letal debido al riesgo de asfixia que producen los edemas de glotis. El HAE se hereda de forma autosómica dominante y está causado por mutaciones en el gen C1 NH que producen una deficiencia cUantitativa (HAE tipo 1)o funcional (HAE tipo 11)de C1 inhibidor (C1-lnh), que es un inhibidor de serin proteasas que regula los sistemas del complemento, calicreína-cininas, coagulación y fibrinolisis. En este estudio se ha analizado el C1NH en una serie de 131 pacientes pertenecientes a 93 familias de toda España, y dicho análisis se ha centrado en las grandes deleciones e inserciones, y mutaciones puntuales en el exón ocho, por ser los dos tipos de mutaciones que más frecuentemente producen el HAE. Para la caracterización de las mutaciones se han empleado las técnicas de SSCP, transferencia Southern, PCR múltiple cuantitativa y secuenciación. En algunos casos concretos se ha completado el estudio con análisis mediante RT-PCR, PCR de fragmentos largos, transferencia wesiern y ELlSA. Como resultado se han identificado 20 mutaciones puntuales en el exón ocho en 30 familias distintas (32%), 13 de las cuales no habían sido descritas previamente. Entre ellas se encuentra la primera~descripción de un paciente con una mutación en homocigosis en la región codificante del C1 NH, que produce un perfil de consumo del complemento similar al que se encuentra en los pacientes con angioedema adquirido. También se han identificado 13 familias (14%) con -grandes deleciones o inserciones en el C1 NH. Entre ellas está la primera descripción de una duplicación de los exones 5 y 6, Y dos casos de deleción del exón 4 en los que se ha secuenciado el punto de corte de la deleción. Estos datos apoyan la hipótesis de que las grandes deleciones y duplicaciones en el C1 NH se producen por la recombinación homóloga desigual entre repeticiones de la familia Alu. A pesar de la heterogeneidad de las mutaciones, su análisis ha revelado y/o confirmado determinados puntos calientes de mutación, algunos de los cuales son responsables del elevado número de mutaciones de nava que se producen en esta enfermedad. El estudio genético ha demostrado su utilidad clínica para ayudar a diferenciar estos casos de nava de los casos de angioedema adquirido, y para alcanzar el diagnóstico definitivo de HAE en algunos pacientes con niveles de complemento en los límites de la normalidad y/o historias familiares que en ocasiones confunden el diagnóstico.

Autor: CABALLERO REYES ANTONIO.
Año: 2004.
Universidad: GRANADA [www.ugr.es].
Centro de lectura: ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDIN CSIC.
Centro de realización: ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN CSIC.

Resumen: El nitroaromático 2,4,6-trinitrotolueno TNT se ha utilizado extensivamente como explosivo militar durante gran parte del siglo pasado. Su manufactura y utilización, así como el desmantelamiento de instalaiones de tratamiento de este explosivo ha provocado la contaminación de acuiferos y de amplias zonas de suelo. Su alta toxicidad, sumado a su carácter mutagénico, además de los extremadamente dificil que resulta su degradación, son las razones que lo han convestido en uno de los contamiantes prioritarios a eliminar por parte de muchas agencias ambientales gubernamentales. La toxicidad y carácter recalcitante se deben, sobre todo, a la presencia de tres grupos nitro, muy electornegativos, distribuidos simétricamente alrededor del anillo aromático que impide un ataque por enzimas oxigenasas. Por tanto, la eliminación de estos grupos nitro genera compuestos que se pueden metabolizar y degradar hasta dióxido de carbono y agua. Pseudomonas putida JLR11 es una bacteria que se aisló en el Grupo de Degradación de Tóxicos Orgánicos (DOT) por ser capaz de asimilar hasta el 85% del nitrógeno del TNT, favoreciendo con ello su degradación. Los objetos de esta Tesis se han centrado en el estudio de las rutas de asimilación del N-TNT en esta cepa, y se ha demostrado por primera vez la existencia de dos rutas alternativas capaces de metabolizar los grupos nitro del TNT en la misma bacteria, de manera que estos pueden liberarse del anillo aromático en forma de nitrito o de amonio. La caracterización de mutantes en pasos claves para la asimiliación de estas fuentes de nitrógeno demustra que el nitrógeno del TNT se incórpora a esqueletos carbonados de la bacteria por la ruta GS-GOGAT. Además, seha caracterizo un enzima nitroreductrasa, denominado PnrA, que participa de manera clave en el metabolismo del nitrógeno del TNT mediante la reducción de éste hasta 4-hidroxilamino-2,6 dinitrotoluno (4-HADNT). De un mutante en el gen pnrA se demuestra que la reducción que esta enzima lleva a cabo es claver para la liberación de los grupos nitro en forma de amonio. Estos resultados demuestran claramente la versatilidad metabólica que posee pseudomonas JLR11 para degradar un compuesto tan contamiente como el TNT.

Autor: ALVAREZ GOMEZ ENRIQUE.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Autor: REGUERA VIDAECHEA JUAN JAVIER.
Año: 2004.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Autor: GUTIERREZ PULGAR JOSE RAMON.
Año: 2004.
Universidad: SALAMANCA [www.usal.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA Y GENETICA.

Resumen: La riboflavina es una vitamina esencial en humanos, implicada en multitud de procesos redox en la célula. Para mejorar la producción de esta vitamina, se ha estudiado la ruta biosintética de purinas en el organismo superproductor Ashbya gossypii para incrementar la disponibilidad del precursor GTP. En este trabajo hemos estudiado dos actividades del metabolismo del IMP: IMP deshidrogenasa e IMP nucleotidasa. El objetivo de nuestro trabajo con la enzima IMP deshidrogenasa codificada por el gen AgGUA1, fue la caracterización del centro de inhibición por GMP. La purificación, cristalización y resolución de la estructura de esta enzima en presencia de GMP, nos permitió identificar los aminoácidos que intervienen en la interacción proteína-inhibidor, y establecer el mecanismo de inhibición. Se realizaron 22 mutaciones por mutagénesis dirigida, para el análisis mutacional de este centro de inhibición, y se comprobó su resistencia a inhibición. También fue llevada a cabo la identificación del ORF codificante para la enzima IMP nucleotidasa tanto en S. cerevisiae como en A. gossypii. Esta identificación se realizo mediante la purificación de la proteína con FPLC y posterior análisis por espectroscopia de masas. El patrón de expresión de este gen muestra como existe un fuerte incremento de esta expresión en condiciones de estrés oxidativo. Por esto comprobamos el efecto del H2O2 sobre el crecimiento y la concentración intracelular de nucleótidos en la cepa isn1. El tratamiento con H2O2 provoca la acumulación de IMP y retrasa el crecimiento de la cepa isn1 mientras que en la cepa silvestre se observa un incremento de inosina. En ausencia del agente oxidativo, la cepa isn1 muestra bajos niveles de inosina e hipoxantina intracelulares, aunque no hay diferencias significativas en el crecimiento. Estos resultados indican que el gen ISN1 juega un importante papel previniendo el desequilibrio de la concentración de nucleótidos y el efecto genotóxico de esto en determinadas condiciones de estrés.

Autor: SANDOVAL DEL AMOR JUAN.
Año: 2005.
Universidad: VALENCIA [www.uv.es].
Centro de lectura: BIBLIOTECA DEL CAMPUS DE BURJASSOT.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA - UNIVERSITAT DE VALÈNCIA.

Resumen: La Pancreatitis Aguda Necrotica (PA) presenta una tasa de mortalidad relativamente alta debido a un fallo multiorgánico en las etapas finales de la patología. Mucho trabajo se ha invertido en esta área de investigación. Sin embargo, los mecanismos moleculares que inician la enfermedad no estan esclarecidos hasta el momento. En este trabajo de Tesis Doctoral se ha estudiado la regulación de la expresión génica de diferentes genes que estan implicados en el inicio y desarro110 de la pancreatitis aguda. Se ha enfocado la investigación en la caracterización de las modificaciones de histonas, transducción de señal y el remodelamiento de la cromatina en los promotores de los genes: "early growth response 1" ( EGR-1), "inter-cellular adhesion molecule 1" (ICAM-1), "interleukin 6" (IL-6) and "tumor necrosis factor a." (TNFa.). Para un análisis exhaustivo y completo, se han utilizado un modelo in viva de PA en rata mediante la administraci6n de taurocolata sodico y un modelo in vitro en cultivo de células acinares AR42J. Durante el desarrollo de este trabajo hemos desarrollado una nueva aplicaci6n de la metodología de inmunoprecipitación de cromatina (ChiP), que hemos lIamado RNApoI-ChIP. Esta aplicaci6n permite el análisis de la transcripción genica en tiempo real y consiste en la detección de la RNA polimerasa II en la región codificante de los genes. Además, hemos estudiado la acción de la pentoxifilina, un posible agente terapeutico frente a la PA, en la expresión de los genes seleccionados. Nuestros resultados apoyan el uso de la pentoxifilina como un agente terapeutico en las fases iniciales de la patología, ya que activa como un regulador de la expresión de los genes implicados en el desarrollo de la PA.

Autor: Garcia Martinez Miguel.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: F.Veterinaria.
Centro de realización: Facultad de Veterinaria.

Resumen: La reacción catalizada por la 6-fosfofructo-1-quinasa (PFK-1) es el paso limitante de la glucólisis. Existen 3 genes que codifican para las tres isoenzimas descritas de la PFK-1: la muscular, la hepática y plaquetaria. La pérdida de la isoenzima muscular de la PFK-1 es la causante de la glucogenosis de tipo VII o enfermedad de Tarui. Ésta se caracteriza por la ausencia de actividad PFK-1 en el músculo esquelético y un déficit parcial en el eritrocito. Los síntomas más comunes son miopatía con intolerancia al ejercicio y anemia hemolítica compensada. Debido a su baja incidencia y a la ausencia de un modelo en ratón, actualmente son poco conocidas las adaptaciones fisiológicas y bioquímicas, así como la interacción entre los diferentes tejidos afectados por el déficit de PFK-1M. En este trabajo se ha generado un modelo murino de glucogenosis de tipo VII mediante técnicas de recombinación homóloga en células ES. Este animal reproducía la sintomatología característica de esta enfermedad asociada con una elevada mortalidad. Así, el músculo esquelético de estos animales presentaba un bloqueo glucolítico que provocaba el acúmulo de hexosas monofosfato y glucógeno. Este bloqueo glucolítico estaba acompañado por una severa intolerancia al ejercicio, caracterizada por una depleción del ATP muscular. Asimismo, el estudio de la musculatura implicada en la respiración reveló una severa afectación morfológica y bioquímica asociada a una posible alteración funcional de este proceso. Del mismo modo, la musculatura cardíaca también estaba afectada por la carencia de PFK-1M. Paralelamente, se estudió si este animal reproducía las alteraciones eritrocitarias descritas en los pacientes. Así, los ratones deficientes en PFK-1M presentaban una hemólisis crónica caracterizada por un elevado número de reticulocitos en sangre. Se observó también una esplenomegalia asociada a un incremento del número de precursores hematopoyéticos en este órgano. El análisis bioquímico del eritrocito evidenció un bloqueo glucolítico con una marcada reducción del 2,3DPG. Esta disminución provocaba una respuesta a hipoxia en la musculatura esquelética caracterizada por la expresión de HIF-1a. Como consecuencia de estas alteraciones musculares y eritrocitarias la musculatura esquelética de los animales Pfkm-/- no podía compensar la carencia glucolítica provocando una situación de estrés energético crónico que se reflejaba en una pérdida de la funcionalidad muscular.

Autor: Grazú Bonavía María Valeria.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: Inst.de Cat. y Petro. CSIC. U.A.M..
Centro de realización: Inst.de Cat. y Petro. CSIC. U.A.M..

Resumen: En esta tesis se propone una nueva estrategia para alcanzar un alto grado de estabilización de enzimas industriales: la rigidificación orientada muy intensa de una determinada región de la superficie enzimática por medio de la optimización de la unión covalente multipuntual sobre soportes activados pre-existentes. El principal objetivo de esta tesis doctoral involucró el desarrollo de los siguientes sub-objetivos: a.- La preparación a medida de soportes disulfuro-epóxido conteniendo: i)- una pequeña proporción de grupos tiol-reactivos capaces de inmovilizar de forma selectiva a la enzima a través de residuos de cisteína insertados en la superficie proteica; ii)- una alta concentración de grupos epóxido capaces de realizar una intensa unión covalente irreversible multipuntual con grupos nucleófilos de la superficie proteica cercanos a la zona donde se introdujo el residuo de cisteína. A su vez, se llevo a cabo la optimización del proceso de unión covalente multipunutal en los soportes mixtos desarrollados. b.- La obtención de distintos mutantes, conteniendo un residuo de cisteína en distintas regiones de la superficie proteica con alto contenido nativo en lisinas. Con este fin se evaluó la estructura tridimensional de la penicilina G acilasa (PGA) de E. coli, y se seleccionaron distintos aminoácidos donde realizar la mutación. Después de evaluar a través de simulación por dinámica molecular que la introducción de las distintas mutaciones no provocaba alteraciones en la conformación de la enzima, los mutantes seleccionados fueron obtenidos por mutagénesis dirigida. c.- La rigidificación orientada de cada uno de los distintos mutantes, con el fin de poder detectar zonas de la superficie proteica más sensibles a la estabilización, la cual resultó ser una región cercana al centro activo de la enzima (región cercana al residuo B380 de la enzima). d.- El enriquecimiento en residuos de lisina de la zona seleccionada (se insertaron hasta 8 nuevos residuos de lisinas en la zona de la superficie proteica cercana al residuo aminoacídico B380) De esta manera, se pudo mejorar de forma notable el grado de rigidificación de esta zona por unión covalente multipuntual. e.- La evaluación de distintos soportes activados con el fin de obtener la mayor rigidificación orientada de la enzima mutada y por lo tanto los mejores factores de estabilización. El soporte glioxil-agarosa permitió inmovilizar a la enzima de forma selectiva a través de la región enriquecida en residuos lisina, y promovió una unión covalente multipuntual muy intensa (alrededor de 20 residuos de lisinas parecen estar involucrados en esta unión covalente multipuntual). Por medio de la búsqueda de las zonas más sensibles de la superficie proteica frente a distintos agentes desnaturalizantes, y la optimización de la rigidificación de esta zona (incrementando el número de lisinas presentes y utilizando un soporte, glioxil-agarosa, que ofrece planos de interacción), fue posible maximizar la congruencia geométrica entre dos estructuras rígidas tan diferentes como son la enzima y el soporte. De esta manera, el mejor derivado enzimático obtenido resultó ser 300.000 veces más estable frente a la temperatura que la enzima soluble o el derivado donde la enzima esta unida de forma unipuntual al soporte. Este factor de estabilización no sólo es mejor que los descritos hasta el momento para la PGA de E. coli, sino que es el más alto que hemos podido encontrar en la bibliografía científica para cualquier metodología de estabilización utilizada hasta el momento con enzimas industriales. Frente a disolventes orgánicos también se observaron factores de estabilización similares. A su vez, la intensa rigidificación orientada de la zona de la superficie enzimática cercana al residuo B380 permitió obtener derivados enz 8 imáticos 2d7 con un comportamiento mejorado en la síntesis cinéticamente controlada de antibióticos beta-lactámicos.

Autor: de la Peña Ingelmo Pablo.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: Inst.de Inv. Bioméd."Alberto Sols" CSIC.
Centro de realización: Dpto. Bioquímica Facultad de Medicina.

Resumen: La replicación del DNA mitocondrial (mtDNA) es uno de los procesos fundamentales que tienen lugar durante la biogénesis mitocondrial. Recientemente se han caracterizado varios factores de la maquinaria de replicación del mtDNA, aunque el mecanismo básico de síntesis de las dos cadenas de DNA está en discusión y se desconocen los elementos que regulan el proceso. El uso de D. melanogaster como sistema modelo animal está constituyendo una herramienta experimental de gran utilidad para el estudio de los componentes que configuran la maquinaria basal de replicación, mantenimiento y transcripción del mtDNA. En nuestro grupo hemos analizado cómo se regula la expresión de diversos genes que codifican factores esenciales para el metabolismo del mtDNA en Drosophila. Al contrario de lo que sucede con la subunidad catalítica de la DNA polimerasa mitocondrial (pol ), la expresión de la subunidad accesoria (pol ) está sometida a una estricta regulación transcripcional, y los niveles del mensajero pol aumentan previamente a la activación de la síntesis del mtDNA durante el desarrollo embrionario. En esta tesis doctoral hemos profundizado en los mecanismos que controlan la expresión de este gen potencialmente clave en la regulación de la replicación mitocondrial. Hemos demostrado que Pol b se expresa en Drosophila en un mensajero bicistrónico funcional que posee características procarióticas. Este mRNA también codifica la subunidad C de la Glutamil tRNAGln amidotransferasa (GatC). Hemos demostrado que GatC se localiza en la mitocondria y es esencial para el proceso de biosíntesis de proteínas, sugiriendo que las mitocondrias animales utilizan una ruta de transamidación para la síntesis del tRNAGln. Diversas evidencias experimentales indican que GatC es una proteína bifuncional que también está implicada en la regulación del número de copias de mtDNA, lo que supone el primer ejemplo de una proteína que controla de una manera directa o indirecta la replicación del mtDNA a nivel celular. El estudio de los mecanismos que regulan la expresión de ambas proteínas ha mostrado que, a diferencia de lo que ocurre en numerosos mRNAs bicistrónicos procariotas, la traducción de polb no depende de la síntesis previa de GatC, sino que ocurre de manera independiente. Sin embargo, la expresión de pol - bse encuentra regulada a nivel traduccional. Este control está mediado por un fragmento de DNA de 93 nucleótidos localizado en el extremo 3´ de la secuencia codificante de gatC que ejerce una fuerte represión sobre la traducción de pol -b

Autor: ROJO SANCHIS ANA ISABEL.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: U.A.M. Fcd. DE MEDICINA. Dpto.BIOQ..
Centro de realización: U.A.M. Fcd. DE MEDICINA. Dpto.BIOQ..

Resumen: El origen de la enfermedad de PArkinson todavía no se conoce con detalle, pero estudios epidemiológicos sugieren que las toxinas ambientales son un importante factor de riesgo. Sin embargo esta hipótesis no está formalmente demostrada porque los modelos desarrollados en animales de experimentación se basan en la entrada de las toxinas através de de vías de entrada no naturales. En este trabajo desarrollamos por primera vez un nuevo modelo para le enfermedad de Parkinson en ratón basado en la inoculación intranasal crónica de MPTP. Trabajos previos del grupo muestran que la quinasa Akt juega un importante papel como sensor de estrés oxidativo, sin embargo los mecanismos moleculares no han sido dilucidados con detalle. En esta Tesis mostramos como al menos en parte Akt ejerce su papel antioxidante induciendo la trasncripción del enzima SOD-1 através de la regulación del factor de transcripción NF-kB.

Autor: RIOLA MACÍAS JOSÉ.
Año: 2005.
Universidad: EXTREMADURA [www.unex.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE INGENIERÍA INDUSTRIAL.
Centro de realización: ÁREA DE GENÉTICA.

Autor: GÓMEZ LÓPEZ GONZALO.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE MADRID [www.uam.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: HOSPITAL RAMÓN Y CAJAL.

Resumen: La supervivencia global de los pacientes con cáncer no ha variado notablemente en los últimos años. La principal razón de este fracaso es la expresión temprana de un fenotipo invasivo en los tumores primarios. La valoración de múltiples marcadores asociados al tumor es fundamental para determinar la presencia de células microdiseminadas y, potencialmente, metastásicas. Sin embargo la escasez demarcadores de microdiseminación tumoral temprana continúa siendo una limitación a día de hoy. En este trabajo se aplican técnicas de biología molecular para el estudio de la diseminación tumoral y la micrometástasis en muestras clínicas. Para ello se lleva a cabo un estudio por RT-PCR del marcador tirosinasa (TYR) en tejido ganglionar, sangre y plasma de pacientes con melanoma maligno. Además, se aplican técnicas de análisis múltiple de expresión génica diferencial sobre un modelo de líneas celulares humanas y metastásicas, con objeto de proponer nuevos genes candidatos a marcadores de metástasis. Finalmente, se estudian los patrones de expresión génica de la línea celular humanas y metastásica PCR3, en presencia de zoledronato con el objetivo de proponer dianas terapéuticas.

Autor: AYUSO LÓPEZ EDUARDO.
Año: 2005.
Universidad: AUTÓNOMA DE BARCELONA [www.uab.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA Y CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA Y TERAPIA GÉNICA.

Autor: Bernal Guzmán Patricia.
Año: 2006.
Universidad: GRANADA [www.ugr.es].
Centro de lectura: Estación Experimental del Zaidín.
Centro de realización: Estación Experimental del Zaidín.

Resumen: La envoltura celular de las bacterias es la barrera que permite al mismo tiempo el aislamiento selectivo y la comunicación con el medio externo según las necesidades. Está compuesta principalmente por lípidos y proteínas. El estudio de los fosfolípidos ante estreses abióticos como la liofilización y la resistencia a disolventes orgánicos ha demostrado la importancia de los mismos y la existencia de una regulación que permite ajustar los componentes de membrana para que ésta siga siendo funcional. Pseudomonas putida KT2440 y DOT-T1E son de gran interés por su posible aplicación en procesos biotecnológicos. P. putida KT2440 es una bacteria saprofita del suelo que coloniza las raíces de plantas y puede estimular el crecimiento de las mismas. El estudio de la conservación a largo plazo de esta cepa es importante por su potencial uso agrobiotecnológico. P. putida DOT-T1E es una bacteria resistente a disolventes orgánicos aislada en el grupo de Degradación de Tóxicos Orgánicos en Granada que puede ser usada en procesos de biorremediación y biotransformaciones en sistemas de dos fases. En P. putida KT2440 hemos demostrado la importancia de los ácidos grasos ciclopropanos para aumentar la supervivencia tras el proceso de liofilización. En P. putida DOT-T1E demostramos el papel de la cardiolipina en la resistencia a disolventes orgánicos; además de los efectos compensatorios de mutaciones con efectos opuestos en la fluidez de membrana. Las bacterias en general y Pseudomonas putida en particular, tienden a tener una membrana lo más plástica posible que pueda adaptarse a los diferentes ambientes que la rodean tratando de minimizar los daños que los distintos agentes estresantes provocan.

Autor: GARCIA OCAÑA MARCOS.
Año: 2006.
Universidad: OVIEDO [www.uniovi.es].
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR. FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La osteomielitis es una infección ósea de difícil tratamiento caracterizada por una destrucción inflamatoria progresiva del hueso. Está influenciada por factores relacionados con la lesión del hueso y los microorganismos inoculados en éste, pero también pueden jugar algún papel los factores genéticos y el sistema inmune. En esta tesis se realizaron estudios destinados a establecer la función de los neutrófilos, células esenciales de la inmunidad innata, en la patogénesis de esta enfermedad. Estos estudios permitieron evidenciar un retraso en la apoptosis de los neutrófilos de sangre periférica de pacientes con osteomielitis en relación con la apoptosis de neutrófilos de controles sano, asociada con altos niveles de IL-6 en suero de estos pacientes. Además se desarrolló un modelo in vitro de osteomielitis en el que los neutrófilos control se estimularon con bacterias típicas de esta infección como S. aureus. En este modelo in vitro se reprodujo el retraso apoptótico de los neutrófilos observado in vivo, y además se comprobó que era dependiente de la síntesis de sustancias reactivas de oxígeno y citoquinas proinflamatorias (IL-6, TNF-a e IL-1b) por parte del neutrófilo y que estaba regulado por un aumento de la expresión del gen Bcl-xL y una disminución de la de Bax. También se realizaron estudios genéticos para encontrar factores de susceptibilidad para el desarrollo de la infección, encontrándose que los polimorfismos bax G(-248)A y cts-g A125G eran significativamente más frecuentes en enfermos de osteomielitis. El avance en el conocimiento de factores genéticos e inmunológicos asociados al desarrollo de osteomielitis, podrían ayudar al desarrollo futuro de herramientas de prediagnóstico como los chips de DNA para análisis de diferentes polimorfismos genéticos vinculados a la osteomielitis. Los resultados aquí presentados también podrían dar pie al desarrollo de técnicas de modificación de la apoptosis de los neutrófilos (inhibidores de las síntesis de citoquinas como la IL-6) que podrían contribuir a evitar que la infección del hueso se cronifique.